張寧1,2，林洪1*， 隋濤2，鐘響2，張藝兵3
(1.中國海洋大學水生生物制品安全性實驗室，青島 266003；2. 煙臺檢驗檢疫局，煙臺 264000；3. 山東出入境檢驗檢疫局，青島 266001)
摘要：牡蠣是我國出口量較大的水產品之一，由于產品本身的特殊性，在生長過程中易產生腹瀉性貝毒（DSP）。本實驗中原料牡蠣DSP生物法檢測結果為陰性，冷凍貯存4個月后檢測結果即為陽性。本研究以分析這一變化原因為目的，采用LC-MS法對DSP生物檢測的陽性樣品進行確認，結果表明，生物法DSP檢測的結果為假陽性，造成生物法DSP檢測中小白鼠死亡的是牡蠣在貯藏過程中產生的脂溶性有毒物質。通過進一步分析，最終確定該有毒物質的成分為牡蠣脂肪水解物-游離脂肪酸。同時本研究對牡蠣在不同貯存溫度和貯存時間下產生的游離脂肪酸含量進行測定，在-10℃貯存溫度下，貯存0、2、4、6、8、10個月，游離脂肪酸的變化范圍為5.2-788.6 mg/kg；在-10℃，-18℃，-25℃貯存溫度下，貯存4個月，游離脂肪酸的變化范圍為389-92.5 mg/kg。
關鍵詞：冷凍 牡蠣 貯存 游離脂肪酸 有毒物質
中圖分類號：S984.3 文獻標識碼：A
Research on Fat-soluble Toxicant in Stored Frozen Oyster
（Zhang Ning1,2, Lin Hong1, Sui Tao2, Zhong Xiang2, Zhang Yi Bing3）
(1.Seafood Safety Laboratory, Ocean University of China, Qingdao 266003; 2.Yantai Inspection And Quarantine Bureau,Yantai,264000; 3.Shangdong Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau, Qingdao 2660010)
Abstrats: Oyster is the larger exports of aquatic products in our country. Due to the specificity of the products, diarrhetic shellfish poisoning (DSP) was easy to enrich in the growth process. In this experiment, DSP biological test results are negative in raw oysters, but positive when it was in frozen storage for four months. The purpose of our research was to analysis this change. LC-MS method was used for biological detection of DSP-positive samples. It confirmed that DSP biological detection was false-positive results, which led to mice died in biological detection of DSP was the fat-soluble toxic substances produced in the process of oysters frozen storage. Through further analysis, the toxic substances was the hydrolyzate of oyster fat -free fatty acids(FFA).At the same time, FFA of oyster were determined at different storage temperature and storage time. FFA changed in the range of 5.2-788.6mg/kg for stored 0,2,4,6,8,10 months at -10℃; FFA changed in the range of 389-92.5 mg / kg for stored 4 months at -10℃, -18℃, -25℃.
Keywords: frozen; oyster; storage; free fatty acids；toxicant
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作者簡介：張寧（1970-11）女, 山東煙臺人, E-mail:ytciqzn@tom.com
通訊作者：張寧，Tel:13605356802
2004年以來，我國出口日本的冷凍牡蠣產品不斷地被日方通報檢出腹瀉性貝毒(DSP)。通過調研了解到，被日本通報的牡蠣產品均為冷凍裹面包粉牡蠣。帶殼原料牡蠣收獲季節為11月份至第二年的4月份，由于日本裹粉牡蠣大多在春季末形成消費高峰，因此帶殼牡蠣須經去殼冷凍成為半成品后進行冷藏備用，加工前進行貝毒檢測。由于貝毒在產品的加工、貯存過程中不會有變化，因此加工企業在出口時通常不再進行貝毒檢測。通過調研發現，被日本通報的牡蠣產品在收購原料或半成品時都進行了貝毒檢測，合格后再進行加工，正常情況下成品不應該出現貝毒陽性的情況。為此，本文對牡蠣產品貝毒檢測陽性的原因進行調查研究，并對其進行進一步分析、控制，以期探討牡蠣產生有毒物質的原因。
1 材料與方法
1.1 實驗材料與設備
新鮮牡蠣，去殼后于冷藏庫冷凍，鮐魚、馬哈魚，脂肪酸標準品：C12:0，C14:0，C16:0，C16:1，C18:0，C18:1, C18:2，C20:5，C22:4，C22:6（Sigma），氫氧化鈉，丙酮，硫酸，乙醚，吐溫-60（均為化學純），正己烷（色譜純），甲醇（色譜純），
GC6890N氣相色譜儀（Agilent），配FID檢測器，INNOWAX石英毛細管柱，檢測條件：檢測器溫度：250℃，柱溫：初溫80℃，以15℃/min升至230℃，保持14min，載氣：氮氣，流量：1.5mL/min，尾吹氣流量：40mL/min，空氣流量：450mL/min，氫氣流量：40mL/min；旋轉蒸發器；均質器；注射器；
昆明系雄性小白鼠（體重16-20g）。
1.2實驗方法
1.2.1牡蠣中脂溶性物質的提取方法
取200g均勻樣品放入均質杯，加入3倍量丙酮均質2min。用布氏漏斗抽濾并收集濾液。對殘渣以檢樣兩倍量再抽濾兩次，合并抽濾液。對抽濾液減壓濃縮去除丙酮。用100mL乙醚和20ml的水洗濃縮物，輕輕震蕩，靜置分層后去除水層,定容至200mL。
1.2.2 游離脂肪酸（FFA）的測定
1.2.2.1 Amberlyst-26(A-26)陰離子交換樹脂的處理：
稱取5g A-26樹脂加入50mL 0.5mol/L的NaOH溶液，振搖30min后傾去NaOH液，依次用去CO2蒸餾水和甲醇洗3次，每次振搖20min，重復處理一次后將A-26樹脂保存于甲醇中。
1.2.2.2 游離脂肪酸的測定
取1.2.1中牡蠣中提取液2mL于具塞三角瓶中，加入15mL丙酮-甲醇（2：1）溶液，加入200mg樹脂，以120r/min水平振搖30min，靜置除去溶劑，用丙酮-甲醇溶液洗滌樹脂5次（共15mL），室溫下氮氣吹干樹脂并轉移至干試管中，加入1mL1%硫酸、2mL甲醇，70水浴30min，充分冷卻后加入2mL正己烷、1mL蒸餾水，振搖至兩相清晰，取1µL正己烷層進行氣譜分析
1.2.3牡蠣脂類提取液毒性研究
1.2.3.1脂肪提取液注射液制備
1.2.1提取液200mL，在茄形瓶減壓濃縮去除乙醚，濃縮物以少量乙醚溶解后再次減壓濃縮去除乙醚，所得濃縮物用1%吐溫60生理鹽水定溶至10mL。
1.2.3.2 SN0294-93 貝類腹瀉性貝毒檢驗方法（生物法）
2 結果與分析
2.1 DSP陽性確認
對半成品牡蠣及貯藏5個月的牡蠣進行DSP測定。測定結果見表1。
表1 不同測定方法測定牡蠣中DSP
Table 1 The results of DSP by different methods
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半成品牡蠣
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貯藏5個月牡蠣
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生物法
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陰性
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陽性
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LC-MS
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陰性
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陰性
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目前，用于DSP檢測的方法主要有小鼠腹腔注射法（生物法）、酶聯免疫法、細胞毒性測試法、HPLC以及LC-MS等方法。其中生物法和HPLC使用較多。在生物法中，由于DSP的提取過程復雜，易受雜質干擾，假陽性結果時有出現[1]。因此我們采用準確度較高的LC-MS 作為驗證方法。
生物法進行DSP檢測方法的主要原理是采用有機溶劑對待測樣品進行萃取，經提純濃縮后加入吐溫溶解后進行小白鼠腹腔注射，根據小白鼠的死亡情況判定被檢樣品是否含有DSP。因此生物法DSP檢測的實際上是脂溶性有毒物質。通過表1的結果，我們可以判定造成生物法DSP檢測中小白鼠死亡的不是DSP，而是牡蠣在貯藏過程中產生的其他物質導致生物法DSP檢測的假陽性。
為了進一步進行驗證，我們又選取了含脂肪較多的鮐魚、馬哈魚進行驗證。
取冷凍一個月及經過兩年冷凍貯存的鮐魚、馬哈魚，按生物法DSP檢測方法進行檢測，結果表明經過長時間貯存的水產品也能造成小鼠死亡（表2）。由于魚類本身不可能含有DSP，因此判定DSP結果實際為假陽性。
冷凍造成牡蠣組織結構不同程度上的破壞，這些變化以不同的方式影響組織內酶的活性，造成冷凍產品成分發生改變[2]。陳慧斌[3]等人的實驗結果也證明，去殼牡蠣容易遭受微生物的侵染，而微生物的作用加劇了牡蠣脂肪的變化。
表2 不同種類的水產品DSP檢測結果（以小白鼠死亡與否衡量）
Table 2 The DSP results of different seafood
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貯存時間
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鮐魚
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馬哈魚
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一個月
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不死亡
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不死亡
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兩年
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死亡
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死亡
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牡蠣中存在較多的脂肪，這部分脂肪在貯存過程中可能發生水解和氧化反應，產生游離脂肪酸及進一步的氧化產物，最終可導致牡蠣嚴重酸敗（油燒）失去食用價值[4]。在隨后對游離脂肪酸毒性研究中發現，游離脂肪酸對小白鼠進行腹腔注射時表現的毒性遠遠高于對其進行口服時的毒性。徐正婕等人[5]也提出游離脂肪酸能夠造成動物的肝損傷，導致試驗動物的肝細胞凋亡和肝纖維化。因此，牡蠣中脂肪最初分解的產物游離脂肪酸就會對小白鼠產生較強的毒性，即貯存的牡蠣半成品在產生明顯酸敗前已表現為生物法DSP檢測結果的陽性。
2.2 游離脂肪酸的測定結果
圖1為多種游離脂肪酸混合標準圖譜，圖2為原料牡蠣脂肪酸圖譜, 圖3為 -18℃牡蠣貯存六個月后游離脂肪酸圖譜。Toru Takagi[6]就純游離脂肪酸的毒性進行了調查，結果發現不同種類的脂肪酸其毒性差異很大, C20:4 n-6、C18:3 n-3、C20:5 n-3表現出高毒性，C18:2 n-6、C18:4 n-3、C22:6 n-3表現出低毒性，C18:1 n-9表現出弱毒性，在貝類中主要的有毒游離脂肪酸為EPA(C20:5n-3)。本實驗通過比較研究發現，牡蠣在不同貯存條件下產生的各種游離脂肪酸的比例大致相同，我們選取C20:5作為游離脂肪酸代表性檢測指標（下同）。
2.2.1同一溫度不同貯存時間游離脂肪酸的測定結果
在-10℃貯存條件下，取0個月、2個月、4個月、6個月、8個月、10個月的樣品進行游離脂肪酸檢測，測定結果見表4。
2.2.2不同溫度同一貯存時間游離脂肪酸的測定結果
在-10℃、-18℃、-25℃條件下貯存四個月，進行游離脂肪酸檢測，測定結果見表5。
對實驗結果進行分析，牡蠣貯存過程中游離脂肪酸變化情況為：在貯存溫度相同的條件下，牡蠣中游離脂肪酸含量隨貯存時間的增加而升高（表4）；在相同貯存時間中，牡蠣中游離脂肪酸含量隨貯存溫度的升高而升高（表5）。
圖1 游離脂肪酸混合標準圖譜
Fig.1 Chromatogram of standard FFA
圖2 原料牡蠣中游離脂肪酸圖譜
Fig.2 Chromatogram of FFA in raw oyster
圖3 -18℃牡蠣貯存六個月后游離脂肪酸圖譜
Fig.3 Chromatogram of oyster FFA for 6 months at -18℃
表4 不同貯存時間下牡蠣FFA(C20:5 n-3)含量
Table4 The content of FFA in Oyster at different reserved time
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貯存溫度
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貯存時間
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游離脂肪酸含量(mg/kg)
(C20:5 n-3)
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-10℃
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0個月
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5.2
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-10℃
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2個月
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257.9
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-10℃
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4個月
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389.0
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-10℃
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6個月
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506.5
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-10℃
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8個月
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645.3
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-10℃
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10個月
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788.6
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表5不同貯存溫度下牡蠣FFA含量
Table5 The content of FFA in Oyster at different reserved temperature
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貯存溫度
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貯存時間
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游離脂肪酸含量(mg/kg)
(C20:5 n-3)
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-10℃
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4個月
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389
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-18℃
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4個月
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238.4
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-25℃
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4個月
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92.5
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2.3牡蠣脂類提取液毒性測定結果
表6為-10℃下5個不同貯存時間的牡蠣脂肪提取液對小鼠進行腹腔注射時的平均致死時間。從結果可看到，牡蠣貯存時間越長，小鼠腹腔注射的平均致死時間越短，說明其提取液的毒力越強。
表6不同貯存時間小鼠的平均致死時間(-10℃)
Table.6 The average terminal time of rats at different reserved time(-10℃)
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貯存時間
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平均致死時間（h）
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0個月
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未死亡
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2個月
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24
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4個月
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20
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6個月
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15
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8個月
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12
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3 討論
新鮮牡蠣干粉中脂肪的質量分數約為 l1.5％，脂肪中含有豐富的n-3多不飽和脂肪酸，特別是 DHA與 EPA約占脂肪酸總量的25%[7]。牡蠣在貯藏期間脂肪主要發生氧化和水解兩種形式的變化[8]。對于本實驗研究的牡蠣產品，由于其在貯存過程中有塑料袋密封冷凍保存，屬于相對缺氧的環境，因此本實驗牡蠣脂肪在貯存條件下發生的主要是水解變化，產物主要為游離脂肪酸。目前生產企業、檢驗檢疫部門等進行DSP檢測時一般采用生物法，即檢測牡蠣產品中的脂溶性有毒物質。游離脂肪酸經腹腔給小白鼠注射后會導致小鼠死亡，從而導致生物法檢測牡蠣中DSP時產生假陽性。
此外游離脂肪酸對小白鼠檢測結果有很大影響，其影響大小不單與量的多少有關，其組成的不同，結果差異也很大。體外細胞培養證實，富含多不飽和脂肪酸的乳糜微粒對單核細胞和內皮細胞的毒性最強，而富含單不飽和及飽和脂肪酸的乳糜微粒幾乎無或很少有毒性[9]。富含油酸、亞油酸等多不飽和脂肪酸的玉米油、魚油可促進酒精、四氯化碳引起的大鼠肝損傷，而富含棕櫚酸等飽和脂肪酸的棕櫚油則可逆轉酒精所致肝損傷[10,11]。其原因為不飽和脂肪酸可激活肝內脂質過氧化反應，且其常優于飽和脂肪酸合成磷脂和TG，從而改變肝內蓄積TG的組成及其對氧應激脂質過氧化損傷的敏感性。而飽和脂肪酸則可減少環氧合酶及TNFα的含量，抗脂質過氧化，并抑制肝組織對不飽和脂肪酸的攝取。實驗中牡蠣樣品1g中僅有幾毫克的游離脂肪酸也可顯出毒性，但其最終的毒性與過氧化物的影響有復雜的聯系，目前還沒有實際的關于貝類的特定指標與小白鼠實驗毒性之間相關的報告。
參考文獻：
[1] 李愛峰,于仁成,李鈞等. 用蛋白磷酸酶活力抑制法檢測牡蠣體內的腹瀉性貝毒. 分析化學.2006,34: 283-287
[2] 葉盛權,鄭賢德. 冷凍對牡蠣品質的影響. 食品研究與開發.2003, 24(l):73-75
[3] 陳慧斌, 王梅英, 王則金, 陳麗嬌. 牡蠣凍藏期間脂肪氧化影響因素研究. 西南大學學報(自然科學版). 2008,30(8):96-101
[4] 勞邦盛, 盛國英, 傅家謨等. 牡蠣中脂肪酸在儲藏過程中的穩定性.色譜. 2000, 18(4) : 340-342
[5] 徐正婕，范建高，王國良.游離脂肪酸在脂肪性肝炎發病中的作用[J].中華肝臟病雜志.2000，8（2）：127-128
[6] Toru Takagi,Yutaka Itabashi. Occurrence of mixtures of geometrical isomers of conjugated tadecatrienoic acids in some seed oils: Analysis by open-tubular gas liquid chromatography and high performance liquid chromatography .Lipids,1981, 16(7)
[7] 汪何雅,楊瑞金,王璋．牡蠣的營養成分及蛋白質的酶法水解[J]．水產學報，2003，27(2)：163-168
[8] 陳慧斌,王梅英,王則金．牡蠣貯藏品質變化及保鮮技術研究進展[J]．河南科技大學學報(自然科學版)，2006，27(3)：71-75
[9] Mabile L Salvayre R, Bonnage MJ,et al. Oxidizablity and subsequent cytotoxicity of chylonlicrons to monocytic U937 and endothelial cells are dependent on dietary fatty acid composition. Free Radic Biol Med ,1995,19:599-607
[10] Galli A, Price D,Crabb D. High-level expression of rat class I alcohol dehydrogenase id sufficient for ethanol-in-duced fat accumulation in tranduced HeIa cells. Hepatology,1999,29:1164-1170
[11] ZeiseI SH da Costa KA . Albright CD,et al. Choline and hepatccarinogenesis in the rat . Adv Exp Med Biol. 1995,375:65-74
《冷凍牡蠣貯存過程中脂溶性有毒物質的變化研究》.doc