二、原理

三、雙層平板法的應(yīng)用1-噬菌體的分離培養(yǎng)

1.試驗詳細(xì)操作步驟

(1)配制底層培養(yǎng)基和上層培養(yǎng)基

底層培養(yǎng)基瓊脂粉含量：1.5%-2%。

底層培養(yǎng)基培養(yǎng)基：無菌水加1.5%-2%瓊脂粉，滅菌，待冷卻至50℃倒平板，凝固后備用。

上層培養(yǎng)基瓊脂粉含量：1%。

(2)傾倒上層培養(yǎng)基

一般情況，待測樣品為噬菌體污染的樣品。

①取培養(yǎng)基：取出上層培養(yǎng)基，冷卻至45℃左右。

②取樣品：用移液器取樣品0.5mL放入上層培養(yǎng)基中。

③取試驗菌：接著用移液器吸取大腸桿菌菌液0.2mL，也放入上層培養(yǎng)基中，沿壁搖勻。

④傾倒平板：將上述混合液快速倒入底層培養(yǎng)基上面，凝固。

(3)培養(yǎng)

上層培養(yǎng)基凝固后，放置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。

2.操作技巧：

(1)底層培養(yǎng)基不宜太厚，覆蓋培養(yǎng)皿底部即可。

太厚上層培養(yǎng)基無法倒入，太薄不能覆蓋培養(yǎng)皿底部，起不到應(yīng)有的作用。

(2)上層培養(yǎng)基滅菌完成后，要搖勻放入水浴鍋中，間隔沿壁搖動。

經(jīng)常搖動，培養(yǎng)基不容易出現(xiàn)結(jié)塊。

(3)水浴鍋溫度調(diào)至60℃，溫度不宜太高或太低。

溫度太高，想用的時候冷卻較慢；溫度太低，凝固的又太快。

(4)上層培養(yǎng)基溫度降至45℃左右，再加入污染菌液和試驗菌。

這個溫度既能保證培養(yǎng)基和菌液混勻，又能保證不凝固不結(jié)塊。

(5)上層培養(yǎng)基要沿壁搖勻，盡量避免產(chǎn)生氣泡。

氣泡太多，噬菌斑鋸齒狀，很難看。

(6)控制好試驗菌濃度。一般正好覆蓋一層菌液為好。

3.注意事項：

(1)酒精燈旁邊操作，時刻保持無菌意識。

(2)雙層平板法相對厚度不易把握，一定要看準(zhǔn)，不能溢出或太厚。