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培養基經高壓滅菌后，用經過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養基上，這個過程叫做無菌接種操作。 在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。
2. 接種針冷卻
接種針滅菌后，移到酒精燈旁邊冷卻，備用。
配制好固體或液體培養基后，利用高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌，經過滅菌后培養基里無任何微生物，在超過經工作臺內，用接種針等將目標菌種接種到培養基中的過程。
劃線分離：
由接種環沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續劃線，微生物細胞數量將隨著劃線次數的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經培養后，可在平板表面得到單菌落。
①取菌種：取出目標菌種，融化后，備用；
②接種針滅菌：灼燒接種針進行滅菌；
③接種針冷卻：將接種針移至酒精燈旁邊冷卻；
④蘸取菌種：甘油管用75%酒精消毒，待酒精揮發完全，在酒精燈火焰略微滅菌（防止烤糊），然后用接種環蘸取一環菌種；
⑤劃線：取已經備好的固體平板，邊轉動平板邊用酒精燈火焰滅菌，打開平板（靠口朝酒精燈），用上述接種環在平板上劃線，先在一側連續劃線3-4次，邊轉動平板邊用酒精燈灼燒接種環，冷卻后，用接種環穿過第一次劃線部分繼續劃線3-4次，同樣方法進行第三次劃線，或第四次劃線（根據菌液濃度和菌種類型確定劃線次數），灼燒接種環；
⑥標記：在平板底部邊緣處標記菌種名稱，日期和其他信息；
涂布法接種：
先將培養基熔化后趁熱倒入無菌平板中，然后用無菌吸管吸取0.1ml 菌液接種在已凝固的瓊脂平板上。再用無菌L 型玻璃棒將菌液在平板上涂抹均勻，將涂抹好的平板平放于桌上20~30min，使菌液滲透入培養基內，然后將平板倒轉，保溫培養，至長出菌落后即可計數。
①取菌種：取出目標菌種平板；
②接種針滅菌：灼燒接種針進行滅菌；
③接種針冷卻：將接種針移至酒精燈旁邊冷卻；
液體接種
將接種環送入液體培養基時使環在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，塞上試管塞再輕輕搖勻。
多用于增菌液進行增菌培養，也可用純培養菌接種液體培養基進行生化試驗，其操作方法與注意事項與斜面接種法基本相同。
傾倒法接種：
吸取1ml 菌液加入平板中，倒入已融化并冷卻至45~50℃的細菌培養基，輕輕轉動平板，使菌液與培養基混合均勻，冷疑后倒置，適溫培養。至長出菌落后即可計數。
螺旋接種法：
可以在無任何全部或中間稀釋的情況下快速細菌接種。對數減少的樣品容量以阿基米德螺旋線的形式被自動分注在旋轉式培養基表面。培養基上每一點的容量可以被知曉和校準。菌液的濃度可以通過培養皿上一定區域的菌落數量除以同區域樣品分注量來計算。
四、微生物檢驗過程中的注意事項
（1）在操作中不應有大幅度或快速的動作； （2）使用玻璃器皿應輕取輕放； （3）在正火焰上方操作； （4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌； （5）在接種培養物時，協作應輕、準； （6）不能用嘴直接吸吹吸管； （7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內消毒。
