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摘要:目的:探討凍融對(duì)發(fā)酵用大腸桿菌甘油保存的影響.方法:將大腸桿菌用10%的甘油溶液制成菌懸液,分成3組,測定各組菌種的活菌數(shù),同時(shí)置-20℃冷凍處理.3組分別被凍融處理1、2、3次.測定凍融處理后、凍存1年及2年各組的活菌數(shù).結(jié)果:隨著凍融次數(shù)的增加,凍融處理后,凍存1年及2年的活菌數(shù)均明顯降低,凍融次數(shù)越多,細(xì)菌存活率越低
結(jié)論:反復(fù)凍融會(huì)降低菌種的存活率.
中圖分類號(hào):R378.21; Q93-336
微生物菌種的保存方法因微生物種類不同而有所不同,國內(nèi)外對(duì)此有較多的報(bào)道[1～3].甘油保存法是生產(chǎn)中常用的方法之一.在甘油保存菌種過程中,細(xì)胞內(nèi)外形成的冰晶會(huì)對(duì)細(xì)胞造成結(jié)構(gòu)上的損傷,從而影響菌種的存活率.本文主要探討了反復(fù)凍融對(duì)發(fā)酵用大腸桿菌甘油保存的影響.為制藥和微生物工作者提供具有參考價(jià)值的數(shù)據(jù).
1.材料
大腸桿菌PJLA605-HIL2.
LB固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨(英國Oxoid)10 g、酵母抽提物(英國 Oxoid)5 g,氯化鈉10 g,溶解并定容至1 000 ml,調(diào)pH至7.2,固體培養(yǎng)基加2%瓊脂.
2.方法和結(jié)果
2.1大腸桿菌培養(yǎng)
將待分離的菌種劃LB平板,以取得單菌落,經(jīng)模擬發(fā)酵選出優(yōu)良菌種,將此菌種接到LB斜面上,30℃,培養(yǎng)24 h.
2.2大腸桿菌凍存
用10%甘油溶液洗下培養(yǎng)好的菌種,并在無菌小燒杯中混勻,制成濃度為1×108個(gè)/ml的菌懸液,然后分裝到eppendorf管中,每支eppendorf管加菌液1 ml,將此菌種分成3組,編號(hào)1、2、3,然后放入-20℃冰箱中保存.
2.3二次凍存
將2.2項(xiàng)中的第2、3組菌種從-20℃冰箱中取出,于28℃～30℃的水浴鍋中融化,然后再放入-20℃冰箱凍存.
2.4三次凍存
將2.3項(xiàng)中的第3組菌種從-20℃冰箱中取出,于28℃～30℃的水浴鍋中融化,然后再放入-20℃冰箱凍存.
2.5存活率的測定
采用平板菌落計(jì)數(shù)法.取LB平板9套,每3套為一組,在每組皿底分別標(biāo)明10-7、10-8、10-9,再取9個(gè)2 ml西林瓶,依次標(biāo)明10-1、10-2、10-3……10-9,并向西林瓶中各加入無菌水0.9 ml.
用微量取樣器精確吸取第1組菌液0.1 ml注入10-1西林瓶中.將10-1西林瓶內(nèi)的菌液混勻,即成10-1稀釋液.再從10-1西林瓶中取稀釋液0.1 ml注入10-2西林瓶中,重復(fù)上述操作,直至制成10-7、10-8、10-9稀釋液.
分別精確取10-7、10-8、10-9稀釋液0.1 ml注入對(duì)應(yīng)的LB平板內(nèi),用玻璃涂布器涂布均勻,于30℃培養(yǎng)24 h后,數(shù)各皿中的菌落數(shù),計(jì)算出同一稀釋度3個(gè)平皿上菌落的平均數(shù),根據(jù)菌落數(shù)計(jì)數(shù)活菌數(shù).
用同樣步驟可計(jì)算出冷凍前3組菌液的活菌數(shù),見表1.
在冷凍后及冷凍后1年、2年分別將3組菌種從-20℃冰箱中取出,于28℃～30℃水浴鍋中融化,用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù),計(jì)算菌種存活率,如表1.
3.討論
在冷凍保存菌種時(shí)加入甘油作保護(hù)劑,雖然可以提高菌種的存活率,但凍融還是會(huì)造成菌體結(jié)構(gòu)上的損傷.菌種每凍融一次,其存活率都會(huì)明顯下降,經(jīng)處理后的菌種保存1年或2年后,凍融次數(shù)越多,其存活率越低.因此,為使菌種有較高的存活率,不宜反復(fù)凍融.生產(chǎn)用甘油菌種一般保存1年,對(duì)1年后的菌種就要對(duì)其篩選活化后再用.
參考文獻(xiàn)
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