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一、實驗目的
了解血球計數板的構造、計數原理和計數方法,掌握顯微鏡下直接計數的技能.
二、實驗原理
測定微生物細胞數量的方法很多,通常采用的有顯微直接計數法和平板計數法.
顯微計數法適用于各種含單細胞菌體的純培養懸浮液,如有雜菌或雜質,常不易分辨.菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數板,一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤(Petrof Hausser)細菌計數板.兩種計數板的原理和部件相同,只是細菌計數板較薄,可以使用油鏡觀察.而血球計數板較厚,不能使用油鏡,計數板下部的細菌不易看清.
血球計數板是一塊特制的厚型載玻片,載玻片上有4條槽而構成3個平臺.中間的平臺較寬,其中間又被一短橫槽分隔成兩半,每個半邊上面各有一個計數區,計數區的刻度有兩種:一種是計數區分為16個大方格(大方格用三線隔開),而每個大方格又分成25個小方格;另一種是一個計數區分成25個大方格(大方格之間用雙線分開),而每個大方格又分成16個小方格.但是不管計數區是哪一種構造,它們都有一個共同特點,即計數區都由400個小方格組成.
計數區邊長為1mm,則計數區的面積為l mm2,每個小方格的面積為1/400mm2.蓋上蓋玻片后,計數區的高度為0.1mm,所以每個計數區的體積為0.1mm3,每個小方格的體積為1/4000mm3.
使用血球計數板計數時,先要測定每個小方格中微生物的數量,再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細胞的數量.
已知:1mm3體積=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以:1mm3體積應含有小方格數為1000mm3/1/4000mm3=4×106個小方格,即系數K=4×106 .
因此:每ml菌懸液中含有細胞數= 每個小格中細胞平均數(N)×系數(K)×菌液稀釋倍數(d)
三、實驗器材
1. 活材料:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面或培養液.
2. 器材:顯微鏡、血球計數板、蓋玻片(22mm×22mm)、吸水紙、計數器、滴管、擦鏡紙.
四、實驗方法
1. 視待測菌懸液濃度,加無菌水適當稀釋(斜面一般稀釋到10-2),以每小格的菌數可數為度.
2. 取潔凈的血球計數板一塊,在計數區上蓋上一塊蓋玻片.
3. 將酵母菌懸液搖勻,用滴管吸取少許,從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴(不宜過多),讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數區,勿使氣泡產生,并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液.也可以將菌懸液直接滴加在計數區上,不要使計數區兩邊平臺沾上菌懸液,以免加蓋蓋玻片后,造成計數區深度的升高.然后加蓋蓋玻片(勿使產生氣泡).
4. 靜置片刻,將血球計數板置載物臺上夾穩,先在低倍鏡下找到計數區后,再轉換高倍鏡觀察并計數.由于生活細胞的折光率和水的折光率相近,觀察時應減弱光照的強度.
5. 計數時若計數區是由16個大方格組成,按對角線方位,數左上、左下、右上、右下的4個大方格(即100小格)的菌數.如果是25個大方格組成的計數區,除數上述四個大方格外,還需數中央l個大方格的菌數(即80個小格).如菌體位于大方格的雙線上,計數時則數上線不數下線,數左線不數右線,以減少誤差.
6. 對于出芽的酵母菌,芽體達到母細胞大小一半時,即可作為兩個菌體計算.每個樣品重復計數2-3次(每次數值不應相差過大,否則應重新操作),求出每一個小格中細胞平均數(N),按公式計算出每ml(g)菌懸液所含酵母菌細胞數量.
7. 測數完畢,取下蓋玻片,用水將血球計數板沖洗干凈,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免損壞網格刻度.洗凈后自行晾干或用吹風機吹干,放入盒內保存.
五、實驗記錄
將實驗結果填入下表中:
| 計數次數 | 每個大方格菌數 | 稀釋位數 | 試管斜面中的總菌數 | 平均值 |
| 第一次 | ||||
| 第二次 |
