​1 目的

1.1學習掌握微生物的幾種接種技術

1.2 建立無菌操作的概念，掌握無菌操作的基本環節

2 實驗說明

將微生物的培養物或含有微生物的樣品移植到培養基上的操作技術稱之為接種。接種是微生物實驗及科學研究中的一項最基本的操作技術。無論微生物的分離、培養、純化或鑒定以及有關微生物的形態觀察及生理研究都必須進行接種。接種的關鍵是要嚴格的進行無菌操作，如操作不慎引起污染，則實驗結果就不可靠，影響下一步工作的進行。

3 實驗器材

3.1 器械和用品

酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。

3.2 菌種和培養基

菌種：大腸桿菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 培養基：普通瓊脂斜面和平板,營養肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。

4 實驗流程

斜面接種法→液體接種法→固體接種法→穿刺接種法。

5 操作步驟

5.1 斜面接種法

斜面接種法主要用于接種純菌，使其增殖后用以鑒定或保存菌種。

通常先從平板培養基上挑取分離的單個菌落，或挑取斜面，肉湯中的純培養物接種到斜面培養基上。操作應在無菌室、接種柜或超凈工作臺上進行，先點燃酒精燈。

將菌種斜面培養基(簡稱菌種管)與待接種的新鮮斜面培養基(簡稱接種管)持在左手拇指、食指、中指及無名指之間，菌種管在前，接種管在后，斜面向上管口對齊，應斜持試管呈45～0度角，并能清楚地看到兩個試管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕培養基表面。以右手在火焰旁轉動兩管棉塞，使其松動，以便接種時易于取出。

右手持接種環柄，將接種環垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分（環和絲）必須燒紅，以達到滅菌目的，然后將除手柄部分的金屬桿全用火焰灼燒一遍，尤其是接鎳鉻絲的螺口部分，要徹底灼燒以免滅菌不徹底。用右手的小指和手掌之間及無名指和小指之間撥出試管棉塞，將試管口在火焰上通過，以殺滅可能沾污的微生物。棉塞應始終夾在手中如掉落應更換無菌棉塞。

將灼燒滅菌的接種環插入菌種管內，先接觸無菌苔生長的培養基上，待冷卻后再從斜面上刮取少許菌苔取出，接種環不能通過火焰，應在火焰旁迅速插入接種管。在試管中由下往上做S形劃線。接種完畢，接種環應通過火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔細灼燒接種環后，放回原處，并塞緊棉塞。將接種管貼好標簽或用玻璃鉛筆劃好標記后再放入試管架，即可進行培養。

5．2 液體接種法

多用于增菌液進行增菌培養，也可用純培養菌接種液體培養基進行生化試驗，其操作方法與注意事項與斜面接種法基本相同，僅將不同點介紹如下：

由斜面培養物接種至液體培養基：用接種環從斜面上沾取少許菌苔，接至液體培養基時應在管內靠近液面試管壁上將菌苔輕輕研磨并輕輕振蕩，或將接種環在液體內振搖幾次即可。如接種霉菌菌種時，若用接種環不易挑起培養物時，可用接種鉤或接種鏟進行。

由液體培養物接種液體培養基時，可用接種環或接種針沾取少許液體移至新液體培養基即可。也可根據需要用吸管、滴管或注射器吸取培養液移至新液體培養基即可（圖 4-5）。

接種液體培養物時應特別注意勿使菌液濺在工作臺上或其他器皿上，以免造成污染。如有濺污，可用酒精棉球灼燒滅菌后，再用消毒液擦凈。凡吸過菌液的吸管或滴管，應立即放入盛有消毒液的容器內。

5.3 固體接種法

普通斜面和平板接種均屬于固體接種，斜面接種法已講了，不再贅述。固體接種的另一種形式是接種固體曲料，進行固體發酵。按所用菌種或種子菌來源不同可分為：

用菌液接種固體料，包括用菌苔刮洗制成的菌懸液和直接培養的種子發酵液。接種時按無菌操作將菌液直接倒入固體料中，攪拌均勻。但要注意接種所用水容量要計算在固體料總加水量之內，否則會使接種后含水量加大，影響培養效果。

用固體種子接種固體料。包括用孢子粉、菌絲孢子混合種子菌或其他固體培養的種子菌。將種子菌于無菌條件下直接倒入無菌的固體料中即可，但必須充分攪拌使之混合均勻。一般是先把種子菌和少部分固體料混勻后再拌大堆料。

5.4 穿刺接種法

此法多用于半固體、醋酸鉛、三糖鐵瓊脂與明膠培養基的接種，操作方法與注意事項與斜面接種法基本相同。但必須使用筆直的接種針，而不能使用接種環。

接種柱狀高層或半高層斜面培養管時，應向培養基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接種針。注意勿使接種針在培養基內左右移動，以使穿刺線整齊，便于觀察生長結果。

6 結果

分別記錄并描繪平板劃線、斜面和半固體接種的微生物生長情況和培養特征。

7 思考

7.1 如何確定平板上某單個菌落是否為純培養？請寫出實驗的主要步驟。

7.2 為什么高氏I號培養基和馬丁氏培養基中要分別加入酚和鏈霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培養基分離一種對青霉素具有抗性的細菌，你認為應如何做？

7.3 試述如何在接種中，貫徹無菌操作的原則?