GB 4789.2-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定

 

一、稱樣：

（1）一般稱量25g，由于稱樣量較大，標準中對于稱樣的準確性未作出明確規定，微生物室常用稱樣的電子天平最大允許誤差為±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原則，即實際稱樣時可根據樣品情況稱取超出25g（如硬質糖果等，檢驗人員應依據樣品實際情況決定如何稱樣）；

 

（2）對于部分食品添加劑已明確須稱取1.0g的，則須嚴格精確稱量。

 

二、樣品稀釋：

（1）固體或半固體：稱取25g樣品于均質袋中，加入已滅菌的生理鹽水225g，稍捏碎（特別是糕點/面包及其他淀粉制品），放入拍擊式均質器均質1min，此時即制備成1：10的樣品勻液。以移液器或滅菌吸取該液體至9mL滅菌生理鹽水試管中，換上新的滅菌移液器槍頭，緩緩吸取液體后反復吹打2次，此時即制備成1：100的勻液，以此類推，制備10倍系列稀釋勻液。

 

（2）液體樣品：直接吸取原液進行檢驗，稀釋時可直接吸取1mL原液到9mL滅菌生理鹽水試管中按照“固體或半固體”的方式稀釋。

 

三、稀釋度的選取：

液體樣品可直接取原液進行檢驗；固體或半固體則必須依據檢驗經驗，選取2-3個適宜稀釋度進行檢驗（一般樣品選取1：10，1：100，1：1000三個稀釋度進行檢驗。若遇到不常做的樣品，可適當延長稀釋度至1：100000甚至1：1000000）。

 

四、質量控制：

空白對照：分別吸取1mL滅菌生理鹽水到平皿中做空白對照。（若空白有菌落生長則該實驗無效）。

 

五、平板計數瓊脂（PCA）：

滅菌條件為121℃、15min。一般情況下于500mL敞口錐形瓶（三角瓶）中配制400mL/瓶。

 

六、有時樣品基質比較特殊，樣品勻液有細小的顆粒與菌落不易區分，此時可采用如下方法進行區分：

 

（1）配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液（又稱紅四唑或紅四氮唑，簡稱TTC），高壓滅菌后避光冷藏備用。紅四唑滅菌條件為：121℃、20min；

 

（2）待PCA瓊脂培養基冷卻至適宜傾注溫度時，無菌加入上述TTC溶液2mL，充分搖勻（此時PCA中TTC濃度為0.005%）。

 

加入TTC的目的及注意事項：培養后，菌落被TTC染成紅色，而樣品顆粒不變色，方便計數；PCA中TTC的濃度不宜過高，否則會抑制微生物的生長，對實驗結果產生影響。（特殊情況下方添加TTC，常規實驗無須添加，特別是對于菌落數量較少的樣品不宜添加。方法來源依據為《化妝品衛生規范》中菌落總數測定相關章節）

 

七、稀釋液：

常采用0.85%氯化鈉溶液（生理鹽水），121℃、15min高壓滅菌后冷卻備用。

 

八、傾注培養基時，根據對樣品污染情況的估計（同一類型樣品的微生物檢測經驗），若樣品有表面蔓延生長的可能性，則待第一次傾注的瓊脂凝固后，可在表面再覆蓋一層瓊脂以避免菌落蔓延而難以計數。

 

九、水產品30±1℃培養72±3h；其它樣品36±1℃培養48±2h。注意：此處的“水產品”是指生魚片、魷魚干等未經深度加工的水產品。

 

十、本標準的重難點為菌落計數及計算。

 

除標準中已說明的要求外，有以下幾點需要注意：

（1）菌落計數時，從低稀釋度的平板開始計數。若所有平板上的菌落數均小于30CFU，則須計數所有平板上的菌落數，但僅采用最接近30CFU的兩個平板的菌落數來計算最終菌落總數。

以固體樣品舉例，菌落數選取、計算過程及結果修約如下：

  

（2）當第一稀釋梯度一個板上菌落數高于30，另一個低于30，則依據標準應當以介于30-300之間的菌落數作為該稀釋梯度的菌落數。（存在爭議，實際遇到該類情況時應謹慎對待）

以固體樣品舉例，菌落數選取、計算過程及結果修約如下：

（3）若所有平板上的菌落數均大于30CFU，則只計數30-300CFU之間的平板上的菌落數，并采用這些數據，依據標準中給定的公式，進行最終菌落總數的計算，此時將大于300CFU的記為“多不可計”，以“TNTC”表示。

以固體樣品舉例，根據標準中給定的公示，菌落數選取、計算過程及結果修約如下：

 （4）若所有稀釋度的平板菌落數都大于300，則不能所有都計為TNTC，必須將最高稀釋度的兩個平板上的菌落逐一地計數，再計算平均數，該平均數為該梯度的菌落總數，其余平板上的菌落數可記為TNTC。

以固體樣品舉例，菌落數選取、計算過程及結果修約如下：

 （5）計算菌落總數時，須嚴格按照標準要求進行計算。

特殊情況：

①若所有平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數。“最低稀釋倍數”并不是固定不變的，與檢驗人員選取的稀釋度有關。如：某樣品多次檢驗后發現菌落總數較高，檢驗人員在梯度稀釋后取1:1000、1:10000、1:100000三個梯度的稀釋液傾注平板，最終所有平板上的均無菌落生長，則計算過程為＜1×1000，最終結果為＜1000CFU；若選取1:10、1:100、1:1000三個梯度的稀釋液傾注平板，均無菌落生長，則最終結果為＜10CFU。因此，稀釋度的選擇對于結果存在較大影響，選擇時應謹慎。

 

②最低稀釋度兩個平板只有一個平板上長了1個菌落，若為固體樣品且本次檢驗的最低稀釋倍數為1:10，此時計算過程為（1+0）/2×10=5，由于默認固體樣品最小檢出量為10CFU，故本次檢驗的菌落總數結果為10CFU。注意：對于該情況一直存在爭議，不同的檢驗人員可能做法不一，有人保留為5CFU，有人保留為10CFU，并無固定做法。（建議檢驗人員保持一貫做法，不要隨意更改）

舉例如下：

 

十一、對于水產品、冷凍食品、速凍食品等菌落總數含量較高、限量值較大的食品類別，建議多增加稀釋梯度（可稀釋至10-4甚至10-5），避免稀釋度較低、濃度較大導致培養后平板上菌落蔓延、彌散而難以計數甚至無法計數。

 

 

GB 4789.10-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗

 

第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗

 

1、7.5%氯化鈉肉湯增菌培養：

（1）若樣品本身在均質后清澈，培養18h觀察呈現一定程度的渾濁（與培養前相比），則接種平板；若18h后仍無變化，繼續培養至24h后無論渾濁與否都接種至平板；

 

（2）若樣品本身在均質后渾濁，則直接培養至24h后再接種平板。

 

2、血平板：36±1℃培養18h后觀察，若有菌落生長或有菌落生長的跡象（無論是否溶血），則應酌情配制NA、BHI并分裝至小試管中（NA 10mL/管、BHI 5mL/管）、滅菌后NA應斜放凝固成瓊脂斜面備用。至血平板培養至24h取出，挑取菌落進行革蘭氏染色鏡檢，同時挑取菌落接種至NA斜面、BHI肉湯管，36±1℃培養24h。

 

3、接種原則：

（1）革蘭氏染色后還剩余10個或10個以上菌落，則NA、BHI分別接種5管；

 

（2）若多于5個（不包括5個）不足10個，則BHI接種5管，剩余的接種NA；

 

（3）5個及以下則全部接種BHI，不接種NA。

 

4、BP平板：36±1℃培養24h后觀察，有菌落生長則取出，無菌落生長則繼續培養至48h后再觀察。若血平板已挑取菌落進行證實試驗，則不必再挑取BP平板上的菌落進行實驗。 若血平板上無菌落生長，則應在24h～48h內逐步觀察BP平板是否長菌或有無長菌跡象，有則需配置BHI及NA，挑取BP上的菌落進行純化、增菌，36±1℃培養24h。  

 

5、血漿凝固酶試驗：

（1）根據BHI管數，取凍干血漿粉，每瓶用移液槍加入0.5mL生理鹽水，使其充分溶解，再換移液槍槍頭取0.3mLBHI培養物加入其中（每管BHI用1個槍頭），振蕩搖勻后于36±1℃培養，計時，每30min觀察一次，如呈現凝固（將試管傾斜或倒置時出現凝塊）或半凝固（一般的液體呈現凝固）則判定為陽性。若一直不凝固，則一直觀察，直至觀察至6h（查看12次）還未凝固，則試驗終止，判定為陰性結果；若中途出現完全凝固或半凝固，則試驗終止，判定為陽性結果。

 

（2）同時取金黃色葡萄球菌標準菌株（ATCC 6538以及CMCC（B）26003各一支）制成菌懸液后作為陽性對照、以滅菌生理鹽水為陰性對照，分別接種至BHI中同步培養后進行血漿凝固酶試驗。

（3）若血漿凝固酶試驗結果可疑，則挑取NA上的菌落接種BHI再次進行試驗。

 

第二法 金黃色葡萄球菌平板計數法

 

1、取1mL樣品稀釋勻液接種3個BP平板（此處并未嚴格按照標準中0.3mL、0.3mL、0.4mL精確取樣，由于如此操作會增加試驗時間，無法在15min內完成試驗）。

 

2、涂布時不要觸及平板邊緣（會導致樣液涂抹不均勻，大部分匯集于邊緣）。

 

3、可用同一根涂布棒從低稀釋度到高稀釋度進行涂布（不用換涂布棒）。

 

4、涂布完成后應稍微放置一段時間使培養基吸收樣品勻液。

 

5、若水珠較多，可正置于培養箱中1～2h后再倒置培養。

 

6、36±1℃培養24h后觀察，有典型菌落生長則進行證實試驗（革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗、劃線血平板）。若無菌落生長則繼續培養至48h后再觀察，有典型菌落生長則進行證實試驗，無典型菌落生長則試驗終止。

 

第三法 金黃色葡萄球菌MPN計數法

 

1、樣品稀釋同菌落總數，取3個連續稀釋度稀釋液（或包括液體樣品原液），每個稀釋度接種3管7.5%氯化鈉肉湯，每管接種1mL，36±1℃培養18h后觀察，若出現渾濁則接種至BP平板，若無變化則繼續培養至24h后再接種至BP平板。

 

2、劃線接種至BP平板，36±1℃培養24h后觀察，有典型菌落生長則進行證實試驗（革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗、劃線血平板）。若無菌落生長則繼續培養至48h后再觀察，有典型菌落生長則進行證實試驗，無典型菌落生長則試驗終止。

 

3、根據證實后的陽性管數差MPN表得出結果。

 

GB 4789.4-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗

（標準補充）

 

1、稱取25g樣品于可封口的均質袋中，再倒入BPW至250g，盡量排去均質袋中的空氣后再封口、均質后直接置于36±1℃培養箱中培養過夜（標準要求為8～18h，一般培養過夜后第二天早晨繼續下一步試驗）

 

2、TTB、SC應酌情配制，現配現用，不宜久置。若BPW放入培養箱的當日時間允許，則可將TTB、SC滅菌、配制、分裝后冷藏以備第二天實驗；若當日時間不允許，則次日早晨滅菌、分裝，下午即可轉接培養。

 

3、TTB：滅菌條件為121℃15min，與一般試驗耗材、培養基的滅菌條件一致，故在滅菌時可考慮同時滅為一鍋。且須同時滅一些帶塞（可帶塑料蓋子）的小試管、10mL移液槍槍頭、1mL移液槍槍頭，在滅菌完成后溫度降至不燙手時，輕輕晃動三角燒瓶使底部白色沉淀物浮起而充分混勻，每100mLTTB中加入1支碘液（陸橋，P-72）、1支0.1%煌綠（陸橋，P-73），充分搖勻至整瓶TTB呈現綠色，此時用移液槍準確吸取10mLTTB至已滅菌的小試管中，蓋上蓋子。取1mLBPW增菌液至1管TTB中，于42℃培養18～24h（若時間允許、或18h后觀察試管仍無渾濁，則培養至24h，否則培養至18h即可）。

 

4、SC：僅需加熱煮沸滅菌（因SC易溶于水，煮沸即可，無需過度加熱），冷卻至不燙手時用移液槍吸取10mL分裝至已滅菌的小試管中，蓋上蓋子。取1mLBPW增菌液至1管SC中，于36±1℃培養18～24h（若時間允許、或18h后觀察試管仍無渾濁，則培養至24h，否則培養至18h即可）。

 

5、BS、XLD應酌情配制，在用前一天配制后備用（兩者僅需加熱滅菌、不添加任何添加劑，無需過度加熱）。BS在不燙手時即可倒成平板，否則容易沉淀或凝固，且在倒平板前應充分搖勻以防止有效成分沉淀于底部（棕色或棕黃色顆粒物）。XLD過度加熱會造成瓊脂不易凝固、劃線時容易劃破，甚至不凝結成塊、無法倒置。

 

6、XLD培養條件：36±1℃培養18～24h。18h后觀察，若TTB、SC增菌液都有菌落生長，則可挑取任意生長良好的菌落進行生化鑒定試驗；若只有其中一種增菌液有菌落生長、或兩者都無菌落生長，則繼續培養至24h再觀察，此時無論菌落生長與否都不再繼續培養，只要其中任一增菌液有典型或可疑沙門氏菌生長則挑取進行生化試驗。

 

7、生化鑒定：

（1）一般情況下，XLD上的任一增菌液長菌，則BS上對應增菌液也會長菌，此時若已挑取XLD上的菌落進行生化試驗，則無需挑取BS上的菌落；或XLD上的兩種增菌液長了形態特征完全相同的菌落，則挑取任一典型菌落進行生化鑒定即可，且無論BS上菌落生長如何，都不再挑取BS上的菌落進行生化試驗。

 

（2）若出現XLD未長菌的增菌液在BS上長菌，則還需挑取BS上的該菌落進行生化試驗。

 

（3）用生化鑒定試劑盒進行生化鑒定，依據產品說明書判斷陰性或陽性，再根據標準中表2～表5的內容逐步進行判定（即生化鑒定試劑盒是將標準中的所有鑒定步驟同時完成，但判定時依然要按照標準逐步判定，只要其中任一階段可判定為非沙門氏菌屬，則不再往下判定，鑒定試驗即終止）

 

（4）若判定為沙門氏菌屬，則可選擇進行或不進行血清凝集試驗。首先應確定該菌落無自凝性，否則無法進行血清學試驗。