血球計(jì)數(shù)板是一種有特別結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片,玻片上有四條溝和兩條嵴,中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái),兩嵴的表比兩平臺(tái)的表面高0.1 mm,每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng),中央0.1 m㎡面積上刻有400個(gè)小方格.通過油鏡觀察,統(tǒng)計(jì)一定大格內(nèi)微生物的數(shù)量,即可算出1毫升菌液中所含的菌體數(shù).這種方法簡(jiǎn)便,直觀,快捷,但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù),并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù).

2、染色

計(jì)數(shù)法:

為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù),而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足,人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法.借助不同的染料對(duì)菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧?可以更方便的在顯微鏡下進(jìn)行活菌計(jì)數(shù).如酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)可用美藍(lán)染色液,染色后在顯微鏡下觀察,活細(xì)胞為無色,而死細(xì)胞為藍(lán)色.

3、比例計(jì)數(shù)法:

將已知顆粒(如霉菌孢子或紅細(xì)胞)濃度的液體與一待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合,在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目,即可得未知菌液的細(xì)胞濃度.這種計(jì)數(shù)方法比較粗放.并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn).

4、液體稀釋法:

對(duì)未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋,根據(jù)估計(jì)數(shù),從最適宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣,接種1毫升到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中,經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù),然后查最大或然數(shù)表MPN(most probably number)得出菌樣的含菌數(shù),根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量.該法常用于食品中微生物的檢測(cè),例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查.

5、平板菌落計(jì)數(shù)法:

這是一種最常用的活菌計(jì)數(shù)法.將待測(cè)菌液進(jìn)行梯度稀釋,取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合,或?qū)⒕�液涂布于已凝固的固體培養(yǎng)基平板上.保溫培養(yǎng)后,用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度,即可算出原菌液的含菌數(shù).一般以直徑9cm的平板上出現(xiàn) 50-500個(gè)菌落為宜.但方法比較麻煩,操作者需有熟練的技術(shù).平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù),而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng),獲得了單克隆.

6、試劑紙法:

在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上,發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用.形式有小型厚濾紙片,瓊脂片等.在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基,其中加入活性指示劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,無色)待蘸取測(cè)試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng).短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)一定密度的玫瑰色微小菌落與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量.試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確,相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差.

7、膜過濾法:

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品,經(jīng)丫叮橙染色,在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光,活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光,而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光.

8、生理指標(biāo)法:

微生物的生長(zhǎng)伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化,例如酸堿度,發(fā)酵液中的含氮量,含糖量,產(chǎn)氣量等,與生長(zhǎng)量相平行的生理指標(biāo)很多,它們可作為生長(zhǎng)測(cè)定的相對(duì)值.

9、測(cè)定含氮量:

大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%,酵母為7.5%,霉菌為6.0%.根據(jù)含氮量×6.25,即可測(cè)定粗蛋白的含量.含氮量的測(cè)定方法有很多,如用硫酸,過氯酸,碘酸,磷酸等消化法和Dumas測(cè)N2氣法.Dumas測(cè)N2氣法是將樣品與CuO混合,在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮?dú)?收集在呼吸計(jì)中,用KOH吸去CO2后即可測(cè)出N2的量.

10、測(cè)定含碳量:

將少量(干重0.2-2.0mg)生物材料混入1毫升水或無機(jī)緩沖液中,用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加熱30分鐘后冷卻.加水稀釋至5毫升,在580nm的波長(zhǎng)下讀取吸光光度值,即可推算出生長(zhǎng)量.需用試劑做空白對(duì)照,用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線.

11、還原糖測(cè)定法:

還原糖通常是指單糖或寡糖,可以被微生物直接利用,通過還原糖的測(cè)定可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況,常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的常規(guī)監(jiān)測(cè).方法是,離心發(fā)酵液,取上清液,加入斐林試劑,沸水浴煮沸3分鐘,取出加少許鹽酸酸化,加入Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液,繼續(xù)加Na2S2O3至終點(diǎn),查表讀出還原糖的含量.

12、氨基氮的測(cè)定:

方法是:離心發(fā)酵液,取上清液,加入甲基紅和鹽酸作指示劑,加入0.02N的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去,加入底物18%的中性甲醛,反應(yīng)數(shù)刻,加入0.02N的使之變色,根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量.根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量,可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況.

13、其他生理物質(zhì)的測(cè)定:

P,DNA,RNA,ATP,NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及產(chǎn)酸,產(chǎn)氣,產(chǎn)CO2(用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)),耗氧,黏度,產(chǎn)熱等指標(biāo),都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定.也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化,最終產(chǎn)氣量,微生物活性三方面的測(cè)定反映微生物的生長(zhǎng).如我所在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上,隨時(shí)監(jiān)測(cè)溶氧量的變化和酸堿度的變化,判斷細(xì)菌的長(zhǎng)勢(shì).