微生物實驗室工作人員，必須有嚴格的無菌觀念，許多實驗要求在無菌的條件下進行，主要原因，一是防止試驗操作中人為污染樣品，二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當造成個人污染。要求如下：

1.1  接種細菌時必須穿工作服、帶工作帽；

1.2  進行接種食品樣品時，必須穿專用的工作服、帽及拖鞋，應放在無菌室緩沖間，工作前經紫外線消毒后使用；

1.3  接種食品樣品時，應在進無菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球將手擦干凈；

1.4  進行接種所用的吸管、平皿及培養基等必須經消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應高壓滅菌或用酒精點燃燒灼三次后使用；

1.5  從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及試管或平皿邊；

1.6  接種樣品、轉種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌活樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒；

1.7  接種環和針在接種細菌前應經火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到針和環與桿的連接處，接種結核菌和烈性菌的接種環應在沸水中煮沸5min，再經火焰燒灼；

1.8  吸管吸取菌液或樣品時，應用相應的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。

二、無菌間使用要求

2.1 無菌間應密封，不得隨意打開，并設有與無菌間大小相應的緩沖間及門，另盡量設有的小窗，以備進入無菌間后傳遞物品。

2.2  無菌間應保持清潔，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與試驗無關的物品；

2.3  無菌間使用前后應將門關緊，打開紫外燈，如采用室內懸掉紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離工作臺1m處，照射時間不少于30分鐘，使用紫外燈，應注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精球輕輕擦拭，除去上面的灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響；

2.4  處理和接種食品標本時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞；

2.5  在無菌間需用安裝空調時，則應有過濾裝置。

三、消毒滅菌要求

微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養基、被污染和接種的培養物等，必須經滅菌后方能使用。

3.1  滅菌前準備

3.1.1  所有需經滅菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密，如用金屬筒應將上面氣孔打開。

3.1.2  裝培養基的三角瓶塞好棉塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包好。

3.2  裝放

3.2.1  大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品不應超過鍋內容積的80%，物品應放置鍋內擱架上或鐵絲筐中。

3.2.2  手提式高壓鍋：將物品分別包扎好，直接放入消毒筒內，物品之間不能過擠。

3.3  設備檢查

3.3.1  檢查門的開關是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。

3.3.2  壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，關好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計所標示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。

3.3.3  對有自動電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應檢查規定的程序，是否符合于進行滅菌處理的要求。

3.4  滅菌處理

手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應按下列步驟進行：

3.4.1  手提式高壓鍋在主體內加入3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復使用時應將水量補足，水變混濁需要更換）。

3.4.2  手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用）。

3.4.3  蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并打開頂蓋上的排氣閥放出冷氣（水沸騰后排氣10～15min）。

3.4.4  關閉排氣閥，使蒸氣壓上升到規定要求，并維持規定時間（按滅菌物品性質與有關情況而定）。

3.4.5  達到規定時間后，對需干燥的物品，立即打開排氣閥排出蒸汽，待壓力恢復到零時，自然冷卻至60℃后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復至零，溫度降到60℃以下再打開蓋取物，以防止突然減壓液體劇烈沸騰活容器爆破。

3.5 滅菌溫度與時間

3.5.1壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間見下表：

3.5.2  滅菌處理：滅菌后物品，劑等，應檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態，未達到者應廢棄。

3.5.3  取出的物品掉落在地或誤放不潔之處，或沾有水液，均視為受到污染，不可作為無菌物品使用。

3.5.4  取出的合格滅菌物品，應存放于貯藏室或防塵柜內，嚴禁與未滅菌物品混放。

3.5.5  凡屬合格物品，應標有滅菌日期及有效期限。

3.5.6  每批滅菌處理完成后，記錄滅菌品名、數量、溫度、時間、操作者。

四、有毒有菌污物處理要求

微生物實驗室所用實驗器材、培養物等未經消毒處理，一律不得帶出實驗室。

4.1  經培養的污染材料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內，并集中存放在指定地點，待統一進行高壓滅菌。

4.2  經微生物污染的培養物，必須經121℃，30min高壓滅菌。

4.3  染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中，最少浸泡24小時，再經121℃，30min高壓滅菌。

4.4  涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后，煮沸洗滌。做凝集試驗用的玻片或平皿，必須經高壓滅菌后洗滌。

4.5  打碎的培養物，立即用5%煤酚皂液或石炭酸噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。

4.6  污染的工作服或進行烈性菌試驗所穿的工作服、帽、口罩等，應放入專用消毒袋內，經高壓滅菌后方能洗滌。

五、玻璃器皿的清洗要求

5.1 目的  

為了保證微生物實驗順利進行，保證實驗結果的準確性，不影響實驗進度，必須把器皿徹底清洗干凈。

5.2  注意事項

5.2.1  任何洗滌方法，都不應對玻璃器皿有所損傷，不能用有腐蝕作用的化學藥劑，也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品來擦拭玻璃器皿。

5.2.2  一般新的玻璃器皿用2%的鹽酸液浸泡數小時，后用水沖洗干凈。

5.2.3  用過的器皿應立即洗滌，放置太久會增加洗滌困難。

5.2.4  強酸、強堿及其它氧化物和有揮發性的有毒物品，都不能倒在洗滌槽內，以免污染環境水質，必須倒在廢水缸中。

5.2.5  含有對人體有傳染性病菌的器具，應先煮沸滅菌后再進行洗滌。

5.2.6  難洗滌的器皿不要與易洗滌的器皿放在一起，以免增加洗滌的麻煩。有油的器皿不要與無油的器皿混在一起，否則使本來無油的器皿沾上了油垢，浪費藥劑和時間。

5.3  洗滌劑的種類：

水、洗衣粉、檸檬洗滌劑、肥皂

5.4  洗滌方法

5.4.1  含有瓊脂培養基的玻璃器皿的洗滌方法：事先應將器皿中的瓊脂刮去，然后用清水洗滌，并用試管刷刷其瓶壁，以除去粘污在壁上的灰塵和油垢。用洗衣粉水洗去油污，然后用自來水沖洗。洗好后的器皿應倒置晾干或置于干燥箱中干燥至無水滴。

5.4.2  載玻片及蓋玻片的洗滌法：新載玻片及蓋玻片先在20%的鹽酸溶液中浸一小時，然后用自來水沖洗2~3次，最后用蒸餾水換洗2~3次。用過的載玻片及蓋玻片，應用紙擦去油垢，再放在5%的洗衣粉水中煮30分鐘后立即用自來水沖洗，然后放在稀的洗液中浸泡2小時，再用自來水沖洗至中性。

5.4.3  移液管、倒管的洗滌方法：新的移液管及倒管先在的５％鹽酸溶液中浸一小時，然后用自來水沖洗幾次，最后用蒸餾水換洗幾次。用過的移液管、倒管先用自來水洗去表面的殘液，再放在洗衣粉水中浸泡一小時以上，再用自來水沖洗至管內壁無殘渣，最后用蒸餾水換洗次，晾干后入恒溫干燥箱中烘干。

六、培養基、無菌水的制備

6.1  基本原理

培養基的種類很多，不同微生物所需要的培養基不同。培養基制成后的物理狀態可分為液體、固體、半固體三種類型。

6.2  器材

三角瓶、試管、燒杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、鋁箔紙、角匙、杜氏小管、硅膠塞、電爐

6.3  培養基的種類

營養瓊脂培養基、乳糖膽鹽發酵培養基、乳糖發酵培養基、伊紅美蘭瓊脂培養基、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養基(附加抗菌素)、平板計數瓊脂、月桂基硫酸鹽胰蛋白凍肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯、EC肉湯、高鹽察氏瓊脂、三糖鐵瓊脂等

6.4  方法步驟

6.4.1  培養基的制備：

6.4.2  稱量：根據培養基的配方，稱取適量藥品于搪瓷杯中；

6.4.3  溶解：用量筒量取所需水量，置電爐上加熱，一邊攪拌，至完全溶解，加熱至沸騰，拔掉電源，待冷卻；

6.4.4  分裝：根據不同需要，立即趁熱分裝入三角瓶或試管中，分裝三角瓶以不超過三角瓶一半為宜，分裝試管一般為管長的1/5（需根據試管的大小而定）。液體培養基如乳糖膽鹽發酵培養基約分裝10毫升左右。

6.4.5  塞硅膠塞：裝好培養基的試管應塞上硅膠塞，松緊合適，緊貼管壁，不留縫隙，約1/2塞入內，這樣即可過濾空氣，避免雜菌侵入，又可減緩培養基水分的蒸發。

6.4.6  包裝：三角瓶棉塞頭部應用錫箔紙包扎，試管集中于試管簍。

6.5  無菌水的制備：

6.5.1  用10ml移液管量取9.2ml蒸餾水（稀釋水）裝入試管中。

6.5.2  用100ml量筒量取95ml蒸餾水（稀釋水）裝入150ml的三角瓶中�？芍蒙僭S玻璃珠于三角瓶內，防止暴沸。

6.5.3  量取240ml蒸餾水（稀釋水）于250ml的三角瓶中，塞上瓶塞用牛皮紙包扎好，高壓滅菌備用。

七、設備使用原則

7.1  實驗設備的使用由實驗員嚴格按照操作說明書進行，其他人員不得隨意操作。

7.2  實驗設備的日常維護保養由實驗員根據設備操作說明書進行，出現不可排除的故障時，經部門總經理批準，商請專業人員維修。

7.3  實驗設備應定期進行計量檢測，確保儀器的準確性。

7.4  實驗員應愛護儀器設備，使用前應檢查，使用后應及時清理清潔，并定期維護保養，下班前應檢查設備電源是否關閉。