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1.菌種保藏步驟

1.1挑選特征典型的純菌菌落。其方法是用接種環挑取少許菌苔，接種至2ml營養肉湯或0.9%氯化鈉溶液中制成菌液，再取一環菌液在營養瓊脂平板上分區劃線，培養后可見單個菌落生長。

1.2凡能產生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽孢進行保種。孢子和芽胞的代謝作用較弱，但對惡劣環境有很強的抵抗。在傳代前，將菌液管放入80℃水浴中作用30分鐘，殺死雜菌繁殖體后用芽孢傳代。  

1.3定期對保藏菌種進行檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退，檢查項目包括菌落形態、染色、鏡檢、生化特性及血清學檢查。

1.4選擇適宜的培養基及保藏方法。

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2.常用菌種的保藏方法

2.1普通瓊脂斜面  用于常用菌株的傳代。在營養瓊脂培養基內按0.5%加入瓊脂粉配制而成。接種培養后，將菌種管用硅膠塞塞緊，置4℃冰箱保存，每隔2～3個月傳種1次。銅綠假單孢菌在冰箱中易發生菌體自溶而死亡，其菌種須放25℃培養箱內保存。

2.2半固體瓊脂  用于常用菌株的傳代。在營養肉湯培養基內按0.5%加入瓊脂粉配制而成。穿刺接種培養后，置4℃冰箱保存，6個月傳種1次。如在培養管內加少量無菌液體石蠟隔絕空氣，減少水分蒸發，可延長菌種的保藏期。

2.3真菌瓊脂斜面  用于真菌的傳代。在真菌培養基內按1.3%加入瓊脂粉配制而成。劃線接種后，20～25℃培養24小時，置4℃冰箱保存，3～6個月傳種1次。

2.4沙氏瓊脂斜面  用于真菌的傳代。配方：蛋白胨10g ，葡萄糖10g，瓊脂粉13g，加蒸餾水1000mL，待上述成分溶化后，搖勻分裝，115℃滅菌20分鐘，趁熱擺成斜面。劃線接種后，20～25℃培養24小時，置4℃冰箱保存，3～6個月傳種1次。 

2.5 40％甘油水  用于細菌的傳代。配制方法：甘油40mL加水至100mL即成。分裝至試管內，每支2mL左右，121℃滅菌20分鐘備用。接種細菌后直接放4℃冰箱保存，6～12個月傳代1次。  

2.6需氣菌、厭氣菌培養基  用于生孢梭菌的傳代。取生孢梭菌CMCCB64941菌液1mL至需氣菌、厭氣菌培養基15mL內，30～35℃培養18～24h，置4℃冰箱內保存3～6個月傳種1次。  

2.7 皰肉培養基  用于破傷風梭菌的傳代。取破傷風梭菌CMCCB64067菌液0.1mL接種于皰肉培養基內，36℃±1℃厭氧培養3～4天，置4℃冰箱保存，6～12個月傳代1次。  

2.8 液氮超低溫保藏法  適用于各類微生物的保藏。液氮溫度可達-196℃，此時菌種的新陳代謝活動已停止，但不會死亡。在配制好的菌液內加10％甘油作為保護劑，分裝于安瓿中，置液氮罐內可保存10年之久。

2.9冷凍真空干燥保藏法  本法廣泛適用于各類微生物的保藏，包括病毒和噬菌體。將菌液混于有保護作用的介質內，分裝于滅菌菌種管內，速凍后抽真空，使菌液很快變為疏松的干燥菌粉，最后在真空狀態下密封管口，菌種保存期最長可達20年以上。

2.10常用菌種的保藏條件及傳種時間，見表1。

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3．菌種檢查與復壯

菌種在傳代保藏過程中，易發生衰退、變異、污染和死亡，因此必須定期檢查。將菌種接種至液體培養基內使之復活，重新分離，純化形成單個菌落，再作菌種鑒定，包括菌落形態、顏色，染色性、鏡下觀察菌體形態等，必要時可做生化試驗及血清學反應。

菌種經人工傳代保藏過程中，由于自發突變而引起特性變弱或消失往往為菌種衰退。使衰退的菌種重新恢復原來的優良特性，稱為菌種復壯。常用方法有：

①分離純化：將菌種接種至營養肉湯培養基培養24小時，取菌液在營養瓊脂平板上分區劃線，培養后挑取典型單個菌落。  

②宿主復壯：將退化菌種接種到相應昆蟲或動植物宿主體內，傳種數代可恢復其原有的特性與毒力。

③抗逆復壯：通過極端的逆境處理使那些退化的細菌死亡，選育健壯的傳代保種。

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4．實驗菌種的管理

菌種應放入專用冰箱，實行雙人、雙鎖保管。菌種應有購入記錄，傳代記錄，領用記錄和銷毀記錄。菌種應定期檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退。菌種傳代應不超過五代。 

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一、為避免污染造成的損失，在凍存細胞前，應該檢查細胞是否污染以及細胞的密度和細胞的活力。

二、細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，經實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞的活力。緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶的形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

三、操作步驟

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(一)細胞凍存

1.配制含10%DMSO、10-20%小牛血清的凍存細胞培養液；

2.用胰蛋白酶將選好的細胞消化下來，消化時一定要掌握好消化的時間，如果時間處理不當，就會導致細胞的死亡，且細胞瓶中的胰酶殘留盡量倒干凈；

3.將消化好的細胞加入適量配制好的凍存培養液，用注射器或吸管輕輕吹打使細胞均勻；

4.將細胞懸液分裝入凍存管中，每管1~1.5mL；

5.在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；

6.凍存的過程：將凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱過夜，取出凍存管移入液氮容器內。

（二）細胞復蘇

1.佩戴厚點的手套，從液氮罐中取出凍存管快速直接放入37℃溫水中，并不時搖動使其在1分鐘內快速融解；

2.在無菌下從水浴中取出凍存管，凍存管用75%酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管或注射器吸出細胞懸液注入離心管中，由于離心管中細胞懸液較少所以再加入適量的培養液混勻；

3.離心，在1000rpm離心5min；

4.將離心管取出，棄去上清液，向離心管中加入含10%小牛血清細胞培養液用吸管或注射器吹打后接種于培養瓶，37℃培養箱靜止置培養；

5.7~8小時后換液繼續培養。

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四、注意事項

1.由于凍存的細胞還受其他因素影響，因此可能有部分死亡細胞，此時在換液時可將不貼壁和漂浮在培養液上已死亡的細胞輕輕倒掉，再補充新的培養液；

2.凍存和復蘇細胞時最好用新配制的培養液；

3.凍存管存取時一定要做好防護工作，以免凍傷。