1. 原理：1mL水樣在營養瓊脂培養基上、在有氧條件下36℃±1℃培養48h后，所得1mL水樣中的菌落總數的方法。

2. 營養瓊脂培養基

   成分：蛋白胨10g；牛肉膏3g；氯化鈉5g；瓊脂10~20g；純水1000mL

   制法：將上述成分混合后，加熱溶解，調整pH為7.4~7.6，分裝于玻璃容器中，經121℃高壓蒸汽滅菌20min，0~4℃冷藏保存。

3. 實驗步驟

   生活飲用水：

   以無菌操作方法用無菌吸管或移液器吸取1mL充分混勻的水樣，注入無菌平皿中，傾注約15mL已融化并冷卻到45℃左右的營養瓊脂培養基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養基充分混勻，每次檢驗時應做一平行接種，同時另用一個平皿只傾注營養瓊脂培養基作為空白對照。

   待冷卻凝固后，翻轉平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培養箱內培養48h±2h，進行菌落計數，即為1mL水樣中的菌落總數。

    

   水源水：

   以無菌操作方法用無菌吸管或移液器吸取1mL充分混勻的水樣，注入盛有9mL無菌生理鹽水的試管中，混勻成1：10稀釋液；

   用無菌吸管或移液器吸取1：10的稀釋液1mL注入盛有9mL無菌生理鹽水的試管中，混勻成1：100稀釋液；

   按同法依次稀釋成1：1000、1：10000等稀釋度的液體備用。每稀釋一個稀釋度，應更換一次1mL無菌吸管或吸頭。

   用無菌吸管或移液器吸取2個~3個適宜稀釋度的水樣1mL，分別注入無菌平皿內。以下操作同生活飲用水的檢驗步驟。

   
   

4. 實驗數據處理

   結果報告：可用眼睛直接觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。

    

   同一稀釋度，若其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的平均菌落數；若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落數分布又很均勻，則可將此半皿計數后×2以代表全皿菌落數。然后再求得該稀釋度的平均菌落數。

   不同稀釋度的選擇及報告方法，見下表。

   

   

    

四、測定方法——酶底物法

1. 原理：

   利用復合酶技術,在培養基中加入多種獨特的酶底物,每一種酶底物都針對不同的細菌酶設計,且包含最常見的介水傳播的細菌,所有的酶底物在被分解時均產生相同的信號。水樣檢測過程中,水樣中存在的細菌分解一種或者多種酶底物,之后產生一個相同的信號,在檢測菌落總數時,這個信號即為在波長366 nm紫外燈下所產生的熒光。使用基于復合酶底物技術(Multiple Enzyme Technology)的培養基,其中酶底物被微生物的酶水解﹐在36℃士1℃下培養48 h后能夠最大限度地釋放4-甲基傘形酮,4-甲基傘形酮在366 nm紫外燈照射下發出藍色熒光,對呈現藍色熒光的培養盤孔槽計數并查閱MPN表,可以確定原始水樣中最可能的菌落總數。

   本方法未稀釋水樣的檢測范圍為<738 MPN/mL。

    

2. 復合酶底物培養基

    

   成分：

   a) 葡萄糖                 1.25 g

   b）無水硫酸鎂              0.2 g

   c) 蛋白胨                 5.0 g

   d) 酵母提取物              3.5 g

   e) 4-甲基傘形酮磷酸酯         0.037 5 g

   f)4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷    0.03 g

   g)純水                 l 000 mL

    

   制法：將上述成分溶解于純水中,調整pH為6.7～7.3,經0.22 um濾膜過濾除菌。制備好的培養基于2℃~8℃條件下保存備用。

    

3. 實驗步驟

   水樣稀釋：
   檢測所需水樣為l mL。若水樣污染嚴重,可對水樣進行稀釋。以無菌操作方法用無菌吸管或移液器吸取1 mL充分混勻的水樣,注入盛有9 mL無菌生理鹽水的試管中,充分振蕩混勻后取1 mL進行檢測,必要時可加大稀釋度,以10倍逐級稀釋。
   
   
   接種培養：
   向一無菌試管中加入9 ml制備好的液體培養基；如選用符合要求的成品培養基,則向裝有0.l g培養基的試管中加入9 mL無菌生理鹽水。取1 mL水樣加入上述試管中,渦旋振蕩混勻。
   將混勻后的水樣倒入培養盤中心位置,將培養盤蓋好,放置在水平桌面上﹐緊貼桌面順時針輕柔晃動培養盤,將待測水樣分配到培養盤的所有孔槽中。
   將培養盤90°~120°豎起,使多余的水樣由盤內海綿條吸收,將培養盤緩慢翻轉過來,倒置放于36 ℃士1℃培養箱中,培養48 h。可疊放培養,不宜超過10層。

    

4. 實驗數據處理

   結果計數
   將培養后的培養盤取出,倒置于暗處或紫外燈箱內,在6 W 366 nm紫外燈下約13 cm處觀察﹐記錄產生藍色熒光的孔數。如未放置在紫外燈箱內,觀察時需佩戴防紫外線的護目鏡。培養盤中的84個孔,無論熒光強弱,只要呈現藍色熒光即為陽性,但海綿條的熒光不計入結果。

    

   

   結果報告
   根據顯藍色熒光的孔數,對照表⒉查出孔數對應的每毫升樣品中的菌落總數的MPN值。如果樣品進行了稀釋,讀取的結果應乘以稀釋倍數并報告之,結果以MPN/mL表示。如果所有孔均未顯熒光,則可報告為菌落總數未檢出。

    

   
   

   

   

    

   不同稀釋度的選擇及報告方法
   選擇菌落總數在<738 MPN/mL.范圍內的稀釋度﹐如果只有一個稀釋度的結果符合此范圍,則將結果乘以稀釋倍數報告結果。
   
   
   若有兩個或兩個以上稀釋度的結果均落在<738 MPN/mL,范圍內,則選擇稀釋度最小的結果乘以稀釋倍數報告結果。
   
   
   若所有稀釋度的培養盤上均無藍色熒光,則以未檢出報告結果。