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液相流動(dòng)相最讓人發(fā)愁的緩沖鹽的,該如何選擇?

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2021-10-25
核心提示:緩沖液的選擇當(dāng)分離酸性或堿性樣品時(shí),通常需加入一定量的緩沖鹽,緩沖鹽的濃度及類型如何確定?1、緩沖鹽的濃度緩沖鹽的濃度對(duì)離

緩沖液的選擇


當(dāng)分離酸性或堿性樣品時(shí),通常需加入一定量的緩沖鹽,緩沖鹽的濃度及類型如何確定?

1、緩沖鹽的濃度

緩沖鹽的濃度對(duì)離子樣品保留值的影響通常較小,濃度一般為10-50mmol/l。

2、緩沖鹽的類型

緩沖鹽類型的選擇,主要取決于所需要的緩沖能力,在反向色譜中,流動(dòng)相中水相的pH和離子強(qiáng)度在開(kāi)發(fā)對(duì)條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對(duì)于離子型化合物,典型的樣品的保留隨pH改變而明顯變化。通常在pH2到4條件下,保留時(shí)間對(duì)pH的微小改變穩(wěn)定性最高。因此建議將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開(kāi)發(fā)的起始pH,包括堿性化合物和一般的弱酸。緩沖鹽溶液的pH值越接近其pka,緩沖能力越強(qiáng)。一般緩沖鹽溶液的pH值應(yīng)在其pka±1的范圍內(nèi)。

3、緩沖鹽的離子締合(反離子對(duì)液相色譜行為的影響與理論解析)

如酸性條件下分離堿性化合物,加入NH4CL,堿性物質(zhì)離子與反離子相互作用的平衡導(dǎo)致它們相互的溶劑化并形成相關(guān)復(fù)合物離子:

[堿]+[Cl]− = [堿+ -- Cl−],在低pH時(shí),堿性化合物被完成質(zhì)子化,溶液陰離子(如CL-)在流動(dòng)相中破壞了堿性物周圍的水分子并增加其疏水性,導(dǎo)致樣品保留時(shí)間增加,當(dāng)鹽濃度大于50mM時(shí),保留時(shí)間略有下降[4],這可能是飽和反離子CI-引起的離子相互作用的屏蔽作用。此外還可以添加硫酸鈉或者高氯酸鈉等改變堿性化合物的保留。

4.緩沖鹽的其它性質(zhì)

緩沖鹽的溶解性、揮發(fā)性和穩(wěn)定性(可能與設(shè)備、樣品和或色譜柱發(fā)生作用)對(duì)某些分離也很重要。如磷酸鹽,在含有高濃度有機(jī)相(70%以上),可能會(huì)析出;一些緩沖劑放置即降解,貯存或長(zhǎng)期使用后其紫外吸收會(huì)增加(如:TFA、三乙胺);一些緩沖鹽能通過(guò)形成離子對(duì),對(duì)樣品發(fā)生作用(如三氟醋酸緩沖劑與陽(yáng)離子樣品,三乙胺與陰離子樣品等);揮發(fā)性的緩沖鹽如碳酸胺、甲酸銨、醋酸銨等可應(yīng)用于蒸發(fā)光散射、質(zhì)譜的檢測(cè)。

5.pH的選擇


通常進(jìn)行分析方法開(kāi)發(fā)時(shí)要求遠(yuǎn)離化合物的pKa,是遠(yuǎn)離主成分的pKa還是遠(yuǎn)離待測(cè)雜質(zhì)的pKa?如果在pKa附件是否方法就不能用?

是各雜質(zhì)的pKa,只不過(guò)平時(shí)經(jīng)常是通過(guò)主成分的pKa來(lái)代表各雜質(zhì),制定遠(yuǎn)離pKa±2。pKa為化合物的酸堿平衡常數(shù),即在該pH條件下,該化合物處于分子離子狀態(tài),分子狀態(tài)化合物,疏水性較強(qiáng),即色譜柱保留時(shí)間較長(zhǎng);離子狀態(tài)化合物親水性較強(qiáng),及色譜柱保留時(shí)間較短。制定的流動(dòng)相pH在待測(cè)組分pKa±2以內(nèi),有時(shí)也是可用的,只不過(guò)可能存在各雜質(zhì)的色譜行為對(duì)pH較敏感,尤其是保留時(shí)間。會(huì)不會(huì)出現(xiàn)裂縫或出現(xiàn)雙峰的現(xiàn)象,個(gè)人認(rèn)為通常不會(huì),因?yàn)榉肿与x子間也存在相互作用力,除非分子疏水作用、離子的親水作用大于分子離子間的作用力,才有可能裂縫/出雙峰。

6.通常開(kāi)發(fā)方法建議在低pH進(jìn)行

大多數(shù)反相柱都可以在pH2-8條件下使用,強(qiáng)酸條件下硅膠基質(zhì)發(fā)生水解,造成塌陷。高pH 條件下硅膠會(huì)溶解,當(dāng)然硅膠柱經(jīng)特殊處理,如硅甲基嵌入、增加亞乙基橋等可以增強(qiáng)填料的耐酸堿性。對(duì)于一般酸堿化合物的分離,建議先從酸性條件起步,無(wú)法達(dá)到目的后再向中性、堿性條件進(jìn)行嘗試(應(yīng)注意色譜柱的耐受性)。

7.調(diào)節(jié)pH的應(yīng)用及注意事項(xiàng)

1、當(dāng)pH改變時(shí),有些酸性或堿性樣品的吸光度會(huì)發(fā)生改變(因?yàn)樽贤馕諘?huì)有溶劑效應(yīng),紅移或藍(lán)移),故在不同pH值時(shí)運(yùn)行的已知化合物無(wú)法保持其峰大小不變。分析方法開(kāi)發(fā)時(shí),通常采用“混標(biāo)”進(jìn)行分離度摸索,無(wú)法采用峰高進(jìn)行標(biāo)識(shí)時(shí),檢測(cè)采用全波長(zhǎng)進(jìn)行峰的定位(采用光電二極管陣列檢測(cè)器)。

2、pH變化可導(dǎo)致離子化合物的k值發(fā)生10倍或更大的變化,根據(jù)需要對(duì)流動(dòng)項(xiàng)(B%)進(jìn)行調(diào)整。

3、在分離一組酸堿官能團(tuán)相似的化合物時(shí),通過(guò)改變pH來(lái)優(yōu)化分離度是個(gè)不錯(cuò)的選擇,但需權(quán)衡方法的抗干擾性,如pH的微小變化(小于0.1單位)導(dǎo)致峰保留的變化(pH接近一種或多種化合物的pKa),可通過(guò)精確量取緩沖劑組成(重量或體積)以精密控制pH值,而不是用pH計(jì)將緩沖劑滴定至理想的pH,日常方法開(kāi)發(fā),盡量避免該條件,方法耐受性非常差,風(fēng)險(xiǎn)極大。

4、偏中性條件硅羥基對(duì)弱堿性化合物的影響,對(duì)于堿性化合物會(huì)與其形成吸附,導(dǎo)致拖尾,解決辦法分別為更換色譜柱、用高濃度的緩沖鹽(>10mM),選擇被硅羥基牢固保留的緩沖鹽陽(yáng)離子(Na+<k+<nh4+<三乙胺+)。< p=""></k+<nh4+<三乙胺+)。<>

5、偏中性條件硅羥基對(duì)電負(fù)性強(qiáng)的化合物的影響(比溶劑出峰還靠前),一個(gè)案例,有一雜質(zhì)在中性色譜條件下,在溶劑前出峰,調(diào)整該方法流動(dòng)相至酸性條件,該雜質(zhì)在色譜柱上有保留。

6、在混合磷酸三乙胺或醋酸三乙胺時(shí),應(yīng)先加入磷酸鹽或醋酸鹽然后再加三乙胺,因?yàn)榧內(nèi)野房赡懿蝗苡谒T谟么姿徜@/甲酸銨控制pH時(shí),由于該鹽吸濕性較強(qiáng),需確定不同摩爾濃度對(duì)分離的影響。確保方法的適用性。

甲醇/乙腈的選擇


反向色譜最常用的甲醇或乙腈,甲醇的截至波長(zhǎng)為205nm,乙腈的截至波長(zhǎng)為190nm,乙腈水系統(tǒng)由于其粘度非常低,塔板數(shù)較高而柱壓較低,是流動(dòng)相的最佳選擇。通常40%的乙腈具有與50%的甲醇相似的溶劑強(qiáng)度。

基于溶劑不同的選擇性,甲醇為類質(zhì)子溶劑,可形成氫鍵,對(duì)于分離酸堿或電負(fù)性強(qiáng)的化合物有提高選擇性,乙腈為極性分子,其碳氮三鍵含有未成鍵電子,能與含有空軌道的化合物結(jié)合,則與甲醇有著不同的化合物選擇性。有時(shí)單用ACN或MEOH可能會(huì)達(dá)不到理想的分離效果,在流動(dòng)相同時(shí)使用ACN和MEOH可改變選擇性以獲得較好的分離效果。簡(jiǎn)言之,在改變分離選擇性的時(shí)候,甲醇細(xì)調(diào),乙腈粗調(diào)。主要是為了調(diào)整流動(dòng)相的粘度和強(qiáng)度,使得分離效果和選擇性有所改善。

離子對(duì)的選擇


適用范圍:使用液相色譜法分析電離能力比較強(qiáng)的樣品時(shí),樣品在反相色譜柱上的保留時(shí)間很短或者根本不保留,這時(shí)要加入相應(yīng)的離子對(duì)試劑,將分析物上的離子進(jìn)行結(jié)合,形成在柱子上有保留的分子。

作用原理:加入離子對(duì)試劑后,它可以與待分析的物質(zhì)(多為在溶液狀態(tài)時(shí)顯以與離子對(duì)試劑相反的電荷)結(jié)合成離子對(duì)而呈中性,疏水性增加而在色譜柱上有保留行為。離子對(duì)類似于膠黏劑,一頭以離子吸引住待測(cè)物(也是離子),另一頭以碳鏈與固定性作用,從而把待測(cè)物保持在固定相上。

試劑選擇:離子對(duì)分為正離子對(duì)和負(fù)離子對(duì),分析酸性樣品(確切的說(shuō)應(yīng)該是作用基團(tuán))用正離子對(duì)試劑,分析堿性樣品用負(fù)離子對(duì)試劑。正離子對(duì)試劑可以吸附帶負(fù)電荷的樣品組分,負(fù)離子對(duì)試劑反之。戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉.....十二烷基磺酸鈉屬于負(fù)離子對(duì)試劑;四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨、四丁基氫氧化銨等屬于正離子對(duì)試劑。離子對(duì)要考慮樣品體系的復(fù)雜性和干擾物的特性,先用碳鏈短的,濃度盡量低,降低對(duì)色譜柱填料的影響,同時(shí)流動(dòng)相的pH值盡可能低以確保離子化程度。

離子對(duì)試劑的濃度:通過(guò)改變被固定相吸附的離子對(duì)試劑的多少,有可能將保留過(guò)程由反相改變?yōu)殡x子交換色譜。這種改變是通過(guò)改變流動(dòng)相中的試劑的濃度實(shí)現(xiàn)的。同常濃度范圍從幾毫摩到幾十毫摩不等。

注意事項(xiàng):三乙胺、醋酸銨也起到部分離子對(duì)試劑的作用,使用離子對(duì)的色譜柱建議專柱專用。

等度與梯度的選擇


梯度洗脫用于方法建立,對(duì)于組分未知的樣品進(jìn)行HPLC方法建立時(shí),即使最終分離擬用等度洗脫仍需先采用梯度洗脫進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)。目的為確定以下幾項(xiàng):

1、初始梯度洗脫分離可以近似估計(jì)出樣品的保留值范圍,為后續(xù)試驗(yàn)選擇等度或梯度提供必要的依據(jù)。

2、若等度洗脫是最好選擇,初始梯度試驗(yàn)可為進(jìn)一步試驗(yàn)提供最佳%B的估算值。

3、初始梯度洗脫實(shí)驗(yàn)可以使整體樣品分離更好、更快。

4、初始梯度洗脫遺漏早與晚流出的低濃度組分的可能性較小。

5、初始梯度通常為線性梯度(全梯度),如5—100%B,根據(jù)雜質(zhì)情況,1.5梯度/min或5梯度/min,進(jìn)行試驗(yàn)。

     梯度洗脫時(shí)由于改性劑在水相的吸收與有機(jī)相中的吸收不同,導(dǎo)致基線漂移,可通過(guò)混合流動(dòng)相的方式進(jìn)行改善。

      通常含量常采用等度方法,有關(guān)檢測(cè)建議采用梯度的方法,在進(jìn)行含量方法確定時(shí),需評(píng)估潛在雜質(zhì)對(duì)主峰的影響及方法的運(yùn)行時(shí)間。 
編輯:songjiajie2010

 
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