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開發方法或方法驗證時最重要的一步就是流動相的選擇和比例的調整。我想大家肯定都遇到過分離度不好或峰形不好的情況，大部分原因就是流動相沒調好，那到底該怎么調，怎么選擇呢？看完下文可能你就知道答案了。
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然后根據出峰情況調整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。
當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，并據此規則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。
1、流動相的性質要求一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。 選擇流動相時應考慮以下幾個方面： ①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。堿性流動相不能用于硅膠柱系統。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。
⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
⑥樣品易于回收。應選用揮發性溶劑。
2．流動相的pH值 采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。 注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。
(三乙胺triethylamine 氨分子中的氫原子被3個乙基取代的產物。分子式(CH3CH2)3N。易揮發的無色液體，有氨的氣味。熔點－114.7℃，沸點89.3℃，相對密度0.7275（20／4℃）。溶于水和乙醇、乙醚等有機溶劑。三乙胺有堿性，與無機酸能生成易溶于水的鹽類。可由N，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應制取，也可用乙醇胺進行氣相烷基化反應合成。用于制橡膠硫化促進劑、潤濕劑和殺菌劑等，也可用作溶劑和用于合成四級銨化合物。)
3. 如何選擇緩沖液PH值在選擇緩沖液PH值之前，應先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka兩個PH值單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰，從HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高于或低于Pka兩個單位，化合物中99％以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉變，苯甲酸的Pka等于4.2，理論上由HH公示得知，當溶液PH值等于2.2時，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2時99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當緩沖液PH值等于2.2時，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱。
4．流動相的脫氣 HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩，突然跳動）。
此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。
除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。
對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。
超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液面不要高出水面太多。
離線（系統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。
在線（系統內）脫氣法無此缺點。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。
一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續脫氣法在電化學檢測時經常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
5．流動相的濾過所有溶劑使用前都必須經0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過”）。用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用于過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴禁用于有機溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對于混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，首選有機相濾膜。現在已有混合型濾膜出售。
6．流動相的貯存流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。
7．鹵代有機溶劑應特別注意的問題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC系統中的不銹鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會反應生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶。總之，鹵代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。
秘訣1：由強到弱
秘訣2：三倍規則
秘訣3：粗調轉微調
