革蘭染色法(Gram stain)是細菌學上最經典的、使用最廣泛的一種染色方法.由丹麥細菌學家革蘭(Christian Gram)于1883年創立.細菌染色后,不僅可以觀察其形態,而且可根據染色結果將細菌分為兩大類,即革蘭陽性菌(G+菌)和革蘭陰性菌(G-菌).

1、原理：

(1)G+菌細胞壁結構致密(肽聚糖層厚),且脂質含量少,乙醇不易滲入脫色；G-菌細胞壁結構疏松(肽聚糖層薄),且脂質含量多,乙醇溶解脂質后易滲入細胞而脫色.

(2)G+菌菌體含有大量核糖核酸鎂鹽,可與碘、結晶紫牢固結合,使已著色的細菌不被乙醇脫色.G-菌菌體內核糖核酸鎂鹽含量小,易被乙醇脫色.

(3)G+菌等電點比G-菌低,在同一pH條件下陽性菌比陰性菌所帶陰電荷要多,故與帶正電荷的堿性染料(結晶紫)結合牢固,不易被乙醇脫色.

2、應用

革蘭染色法的實際應用意義有三：

(1)按照革蘭染色法可把細菌分為G+和G-兩大類；

(2)G+菌和G-菌的致病性不同,所致疾病各異；

(3)對G+和G-菌,選擇不同抗菌物治療.

3、材料　

(1)葡萄球菌和大腸埃希菌培養18～24h后的混合菌液.

(2)蘭染色液：結晶紫染液、碘液、95%酒精、稀釋復紅或沙黃染液.

(3)載玻片、接種環、酒精燈、吸水紙、顯微鏡等.

4、方法

標本片制備

(1)載玻片準備：取一張清潔載玻片,用蠟筆在其背面畫出二個有一定間隔、直徑約1～2cm的涂抹范圍,用數字或符號做好標記.

(2)涂片：將接種環在火焰上燒灼滅菌,冷卻后取菌液直接涂布在標記的涂抹范圍內.接種環在火焰上燒灼滅菌.

(3)干燥：涂片最好在室溫下自然干燥,或將標本面向上,置于離酒精燈火焰約半尺高處緩慢烘干,切不可放在火焰上燒干.

(4)固定：將干燥后的涂片用片夾夾住,使涂抹面向上緩慢通過火焰3次,然后自然冷卻.固定即可殺死細菌,并使細菌固著于玻片上,以免染色時脫落；又可使細菌蛋白凝固,而易著色.

革蘭染色法：

(1)初染：在固定好并冷卻了的涂片上滴加結晶紫染液1～2滴,作用1min后,用細水流從玻片的一端把游離的染液洗去.

(2)媒染：滴加盧戈(Lugol)碘液數滴,作用1min后水洗.碘液是媒染劑,使結晶紫染液與細菌結合更牢固.

(3)脫色：滴加95%酒精數滴,輕輕晃動玻片,使玻片上流下的酒精液無紫色為止(約需0.5～1min),流水沖洗.

(4)復染：滴加稀釋復紅(或沙黃)染液數滴,作用1min后流水沖洗.最后用吸水紙印干標本片或自然干燥后,玻片上滴加香柏油,用油鏡觀察.

5、結果

G+菌染成紫色；G-菌染成紅色.

6、影響因素

⑴操作因素：涂片太厚或太薄,菌體分散不均勻,可影響染色結果.固定時避免菌體過份受熱.脫色時間要根據涂片厚薄靈活掌握.

⑵細菌因素：不同時間培養物,革蘭染色結果有差異,如葡萄球菌幼齡菌染成紫色.而老齡菌被染成紅色.細菌染色時最好用18～24h的細菌培養物.

⑶染液因素：所有染色液應防止水分蒸發而影響濃度,特別是盧戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用.脫色酒精以95%濃度為宜,若瓶密封不良或涂片上積水過多,可使酒精濃度下降而減弱其脫色能力.

二、細菌莢膜染色法(Hiss法)

1、原理與應用　

細菌莢膜是細菌細胞壁外面的一層粘液性物質.其對染料的親和力弱,不易著色,通常采用負染色法染色,即使菌體和背景著色而莢膜不著色.因此在菌體周圍呈一透明圈.由于莢膜含水量在90%以上,染色時一般不用熱固定,以防莢膜皺縮變形.莢膜染色法用于有莢膜細菌

如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、炭疽芽胞桿菌及產氣莢膜梭菌的鑒定.

2、材料

⑴莢膜菌液

⑵結晶紫酒精飽和液5ml,加蒸餾水95ml 混合液.

200g/L⑶硫酸銅水溶液.

3、方法

將莢膜菌涂片,在空氣中自然干燥,不需加熱固定.滴加結晶紫染色液,在火焰上微微加熱,使玻片上染液冒蒸汽為止,不要水洗,再用200g/L 硫酸銅水溶液沖洗染液,切勿用流水沖洗.用吸水紙吸干后油鏡觀察.

4、結果

細菌菌體呈紫色,莢膜呈淡紫色或無色.

三、細菌鞭毛染色法

1、原理與應用

細菌鞭毛為細菌的運動器官.其形態細長,直徑約10～20nm,需用電子顯微鏡才能觀察到.若用特殊染色使鞭毛增粗并著色,則在普通光學顯微鏡下也可觀察到.鞭毛染色方法很多,但原理基本類似,即在染色前先經媒染劑處理,使鞭毛增粗,然后再進行染色.

2、材料　

(1)變形桿菌6～8h血瓊脂平板培養物.

(2)染色液.

A液：200g/L鉀明礬液(加溫溶解)20ml,50g/L石炭酸液50ml,200g/L鞣酸液(加溫溶解)20ml.

B液：復紅酒精飽和液.

取A液9份和B液1份混合后立即過濾.濾液放置6h后,使用最佳.

（3）蒸餾水管

3、方法

(1)細菌標本制備：取變形桿菌血瓊脂平板培養物,仔細從菌膜伸展最遠處挑取菌少許,輕輕放入蒸餾水管中,經數min使其自行分散,再3725℃～30min.

(2)涂片：取上述菌液一接種環,輕輕滴于載玻片上,使成薄膜.涂抹時接種環隨水滴移動,切勿與玻片相磨,以免鞭毛脫落.

(3)染色：涂片自然干燥(勿用火焰固定)后,加染色液作用1～2min ,水洗、吸干、鏡檢.

4、結果

鞭毛呈淡紅色,菌體呈紅色.

四、細菌芽胞染色法

1、原理與應用

芽胞具有高度的折光性,外膜致密,滲透性低,故普通染色法不易使其著色,芽胞染色法是根據芽胞既難以著色,而一旦著色又難以脫色的特點設計的.所有芽胞染色法都基于同一個原則：采用著色力強的染料,并加熱以促進標本著色,然后使菌體脫色,而芽胞上的染料仍保留,經復染后,菌體和芽胞呈現不同的顏色.

2、材料

(1)破傷風梭菌48～72h培養物

(2)石炭酸復紅液、堿性美蘭液、95%酒精

3、方法

(1)將破傷風梭菌培養物涂片,自然干燥,火焰固定,滴加石炭酸復紅液,并加溫至產生蒸汽(不可煮沸)約5min,防止染液干涸,隨時補充,待載玻片冷卻后,水洗.

(2)用95%酒精脫色2min,水洗.

(3)滴加美蘭染液復染30sec,水洗,待干,鏡檢.

4、結果

芽胞呈紅色,菌體呈藍色.

五、抗酸染色法

1、原理與應用

結核分枝桿菌對苯胺染料一般不易著色,若加溫或延長染色時間使其著色后,再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色,經此染色后,結核分枝桿菌及其他分枝桿菌呈紅色,而非抗酸菌和細胞雜質等呈藍色.

2、材料

(1)結核病人痰

(2)抗酸染色液

(3)玻片、片夾、濾紙片、竹簽、空平皿、污物盆.

3、方法

(1)取潔凈的竹簽沾取痰中血絲或膿性痰,在清潔無油脂玻片上涂開.涂抹區約拇指蓋大.用過的竹簽放到空平皿內待高壓滅菌.

(2)涂片自然干燥后,用片夾挾住玻片一端,通過火焰固定.

(3)涂抹面用濾紙片蓋上,然后往濾紙片上滴加石炭酸復紅染液,使濾紙片完全被染液浸濕,持玻片在小火上加溫片刻然后離開火焰,此時可見到玻片上冒出蒸氣.待蒸氣消失后再加溫,如此反復3～4次,約5min,加溫時隨時添加染液勿使紙片干涸.

(4)玻片冷卻后,用接種環挑去濾紙扔到污物盆內,流水沖洗玻片.

(5)滴加3%鹽酸酒精脫色,至涂抹均勻部位基本沒有紅色再脫下為止,水洗.

(6)滴加呂氏美藍染液30sec,水洗.

(7)吸干、鏡檢.

4、溶液配制

萋－尼(Zichl-Neelsen)抗酸染色液

(1)石炭酸復紅液：鹼性復紅4g,溶于95%酒精100ml,作成飽和溶液,再取該飽和液10ml與5%石炭酸溶液90ml混勻即成.

(2)3%鹽酸酒精液.

濃鹽酸3ml加入95%酒精97ml中即成.

(3)呂(Loeffer)氏美藍染色液

美藍2g,溶于95%酒精100ml中,作成飽和液.再取該飽和液30ml與0.01%氫氧化鉀水溶液100ml混合均勻即可.

六、奈瑟染色法

1、材料

(1)染液甲

第一液：美蘭1g,95%酒精30ml,冰醋酸50ml,蒸餾水100ml.

第二液：結晶紫1g, 95%酒精10ml, 蒸餾水300ml.

以上第一液二份,與第二液一份混合之.

(2)染液乙,黃叱精1或2g,熱蒸餾水300ml,待溶解后過濾.

2、染色法

(1)涂片按常規法固定后,滴加奈瑟染液甲液數滴于涂片上,15～30 Sec,水洗.

(2)用奈瑟染液乙液復染10～30秒鐘.

(3)迅速用水洗,吸干、鏡檢.

3、結果

菌體呈鮮明黃色、異染顆粒呈深紫蘭色.