溶血空斑形成試驗的基本原理是將經綿羊紅細胞免疫小鼠的脾細胞與一定量的綿羊紅細胞混合，在補體參與下，使抗體形成細胞周圍那些受到抗體分子致敏的綿羊紅細胞溶解，形成肉眼可見的溶血空斑。根據所操作的方法不同可分為直接溶血空斑試驗，間接溶血空斑試驗，瓊脂固相法，小室液相法，單細胞層法等等。下面介紹直接溶血空斑形成試驗。

　　二、操作步驟：

　　1. 底層瓊脂平皿的制備：將1.4％瓊脂加熱融化后傾注于平皿內，每個平皿6ml，凝固后置濕盒37℃備用。

2. 0.7％瓊脂加熱融化后加入華氏管內，每管2ml，47～49℃水浴保溫備用。

　　3. 免疫小鼠脾細胞懸液制備：用4×10３ 個綿羊紅細胞(SRBC)鹽水懸液腹腔免疫小鼠，對照為等量生理鹽水。4天后，小鼠拉脫頸椎處死，取出脾臟，用RPMI164。洗一次后置平皿中不銹鋼篩網上,用注射器針芯研磨成懸液,洗滌兩次,調整細胞數為3～8×10６/ml。臺盼蘭染色查活細胞數應大于90％。置4℃冰箱備用。

　　4. 試驗平皿的制備：依次將預溫40℃左右的25％SRBC、牼-SRBC吸收的滅活胎牛血清以及保存于4℃的脾細胞懸液各0.1ml加入預熱47～49℃的含0.7％瓊脂的華氏管中，迅速混勻，立即傾注于鋪有底層瓊脂的平皿內，凝固后，置37℃孵育1小時。

5. 加入1∶5～1∶10稀釋的新鮮豚鼠血清0.5～1.0ml，使其均勻覆蓋表面,再次置37℃溫育30分鐘，即可用肉眼或借助于放大鏡進行空斑計數。

　　三、試劑和器材 免疫學實驗技術論壇  http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html

　　㈠ 試劑

　　1. 1.4％瓊脂：用pH7.4PBS配制。

　　2. 0.7％瓊脂：用pH7.4PBS配制

3. 25％SRBC鹽水懸液

4. RPMI1640

5. 胎牛血清，56℃30分鐘滅活，并經SRBC吸收

　　6. 補體：新鮮豚鼠血清，用前經SRBC吸收后，用RPMI1640稀釋。

　　㈡ 器材：玻璃平皿7×1.5cm，三角燒瓶，水浴箱(47～49℃)，華氏管，1ml注射器，不銹鋼篩網，青霉素瓶，離心管，不同規格加樣器等。

四、注意事項：

　　1. 0.7％瓊脂必須置47～49℃水浴融態保溫。如溫度過高會導致SRBC溶血或所加入脾細胞的死亡。溫度過低則在操作過程中瓊脂發生凝固，影響上層瓊脂平板的制備

2. 離體的脾細胞應置4℃冰箱保存，防止抗體分泌和細胞死亡。

　　3. 在制備試驗平皿時，對于所有玻璃器皿和各種試劑 ，均需預溫，牭1各種試劑加入華氏管后，應與0.7％瓊脂 迅速充分混勻，然后立即傾倒于底層瓊脂 上，并避免傾入氣泡。

　　4. 加入的補體應均勻覆蓋于表層瓊脂上。

　　5. 制備底層平皿和試驗平皿時，均須將平皿置于水平臺上，以保證瓊脂面鋪平。