甘草是新疆蘊藏量大、藥用價值高的一種荒漠草原藥用植物，其主要有效成分為甘草酸和黃酮類化合物。甘草黃酮具有明顯的抗腫瘤、抗潰瘍、抗菌、抗變態反應、降血脂和鎮痛的作用，并對愛滋病病毒有很強的抑制增殖作用，是甘草有效成分開發的熱點。

      目的建立甘草苷和甘草酸的HPLC含量測定方法。方法使用KromasiL-C18（4.6mm×200mm，5μm）柱，甘草苷采用乙腈-0.5%醋酸（20:80）為流動相，檢測波長276nm，柱溫為室溫；甘草酸流動相為甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰乙酸（67∶32∶1），檢測波長252nm，柱溫為室溫。二者流速均為1.0ml·min-1，采用外標法定量測定。結果甘草苷在2.7～27μg·ml-1范圍內呈良好線性關系（r=0.9997）；甘草酸在6～36μg·ml-1范圍內呈良好線性關系（r=0.9998）；甘草苷和甘草酸的平均回收率分別為101.4%和101.3%，其RSD值分別為1.18%和1.22%。結論該方法操作簡便、準確，線性相關系數良好，且穩定性和重復性好，適用于甘草黃酮粗提物及純化物中甘草苷和甘草酸的含量測定。

      經典的黃酮含量測定方法，是以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法測定［3～5］，但此方法用于甘草黃酮的測定尚有諸多不足之處。甘草黃酮的主要成分甘草苷，是反映甘草黃酮內在質量的一個重要指標［6］。本研究以甘草苷為對照品，采用HPLC法測定甘草黃酮含量的方法，同時研究優化以HPLC測定甘草酸含量的方法，以期為甘草有效成分的綜合開發利用和質量監控提供新的方法和思路。

      1儀器與材料1.1儀器LC-10A高效液相色譜儀（日本島津）；SPD-10A可變紫外檢測器（日本島津）；萬分之一天平（Sartorius）；KQ-250B型超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）。

      1.2材料甘草（石河子天德中藥廠）。甘草苷對照品、甘草酸單銨鹽對照品（均購自中國藥品生物制品檢定所）；95%乙醇（A.R）、冰醋酸（A.R）、乙酸胺（A.R）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）。

      2方法與結果2.1色譜分析條件2.1.1甘草苷檢測條件色譜柱為KromasiL-C18（4.6mm×200mm，5μm）；流動相為乙腈-0.5%醋酸（20∶80）；紫外檢測波長：276nm；流速1.0ml·min-1；柱溫為室溫；進樣量20μl。理論塔板數按甘草酸銨峰計算應不低于4000。對照品和甘草黃酮粗提物的色譜圖見圖1～2。

      2.1.2甘草酸檢測條件色譜柱為KromasiL-C18（4.6mm×200mm，5μm）；流動相為甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰醋酸（67∶32∶1）；紫外檢測波長252nm；流速1.0ml·min-1；柱溫為室溫；進樣量20μl。理論塔板數按甘草酸銨峰計算應不低于2000。

      2.2對照品及供試品溶液的配制2.2.1對照品溶液的配制取甘草苷和甘草酸單銨鹽對照品適量，精密稱定，用流動相配制成濃度為54μg·ml-1的甘草苷對照品溶液和120μg·ml-1的甘草酸單銨鹽對照品溶液。

      2.2.2供試品溶液的制備精密稱取甘草黃酮提取物適量，用相應的流動相溶解，定溶于10ml量瓶中，作為甘草苷供試品溶液。

      精密稱取甘草黃酮提取物適量，用相應的流動相溶解，定溶于10ml量瓶中，作為甘草酸供試品溶液。

      2.3檢測波長的選擇以流動相為參比溶液，在200～400nm波長范圍內分別對甘草苷和甘草酸對照品溶液進行掃描，結果表明，甘草苷在276nm處有一最大吸收峰，甘草酸在252nm處有一最大吸收峰，所以選定276nm為甘草苷的檢測波長，252nm為甘草酸的檢測波長。

      2.4線性關系的考察精密吸取甘草苷對照品儲備液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00ml于10ml量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，搖勻；再精密吸取甘草酸單銨鹽對照品儲備液0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00ml于10ml量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻；分別按“2.1”項色譜條件進行測定，以峰面積A（μV·s）對進樣濃度C（μg·ml-1）作回歸統計，結果：甘草苷在2.7～27μg·ml-1范圍內線性良好，回歸方程：A=24962C 7161.1，r=0.9997。

      甘草酸在6～36μg·ml-1范圍內線性良好，回歸方程為：A=23653C 23125，r=0.9998。

      2.5精密度實驗取同一供試品溶液，重復進樣6次，求得甘草苷的RSD為0.74%，甘草酸的RSD為0.92%，說明本方法精密度良好。

      2.6重復性實驗按“2.2.2”項制備同一批號供試品溶液6份，按擬定的色譜條件分別測定甘草苷和甘草酸的含量，測得甘草苷的RSD為1.32%，甘草酸的RSD為1.04%，表明重復性較好。

      2.7穩定性實驗配制同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12，24，36，48h后進樣，求得甘草苷的RSD為1.44%，甘草酸的RSD為0.89%，表明樣品溶液在48h內穩定。

      2.8回收率實驗取已知含量的同一供試品溶液各5份，分別精密加入同一濃度同一體積的甘草苷對照品溶液，甘草酸單銨鹽對照品溶液，混勻，進樣，按上述方法測定甘草酸和甘草苷的含量，測得甘草苷和甘草酸的平均回收率分別為101.4%，101.3%；RSD值分別為1.18%，1.22%。表明本實驗所確定的HPLC法進行甘草苷和甘草酸的含量分析，準確度較高。結果見表1。表1甘草酸和甘草苷的回收率實驗結果2.9樣品測定分別精密稱定甘草黃酮粗提物和純化物各3份，適量，按“2.2.2”項方法制備所需的供試品溶液，按“2.1”項的色譜條件分別測定甘草苷和甘草酸的峰面積，計算甘草黃酮粗提物（烘干樣）中甘草苷和甘草酸的純度分別為3.68%和18.38%，甘草黃酮純化物（烘干樣）中甘草苷的純度為17.29%，未檢測到甘草酸。

      測定項甘草黃酮粗提物123平均值RSD甘草黃酮純化物123平均值RSD甘草酸純度18.2518.5118.3918.380.71-----甘草苷純度3.623.733.693.681.5117.1617.3117.4017.290.70“-”為未檢測到。

      3討論3.1甘草苷流動相的選擇考察了選用不同比例的乙腈-0.5%醋酸為流動相時對甘草苷的保留時間及分離度的影響。實驗結果表明，以乙腈-0.5%醋酸（10∶90）為流動相時，保留時間短，但峰形較差，乙腈比例增大后峰形變得較尖銳對稱，響應值顯著增大，分離度逐漸改善，保留時間先增大后縮短，當乙腈比例大于20%后，未檢測到甘草苷，綜合考慮，選用乙腈-0.5%醋酸（20∶80）為流動相，甘草苷的保留時間適中，分離效果好。

      3.2甘草酸流動相的選擇本實驗分別選用不同比例的甲醇-2%乙酸，甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰醋酸（67∶32∶1）為流動相，實驗結果表明，甲醇-2%乙酸（73∶27）和甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰乙酸（67∶32∶1）為流動相時，分離效果均較好，但在流動相的穩定性和分析時間的合理性方面，后者更優越，因此選用甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰醋酸（67∶32∶1）為流動相。

      按本法分別對甘草苷和甘草酸進行高效液相色譜分析，具有回收率和線性相關系數良好，操作簡便，快速，樣品用量少，精密度和重復性好，自動化程度高等優點，適用于甘草黃酮粗提物及純化物中甘草苷和甘草酸的質量控制，具有廣泛的應用前景。