一、免疫膠體金技術的基本知識

1、膠體金的概念

氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。

2、免疫金標記技術

膠體金顆粒表面負電荷與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。膠體金對蛋白質有很強的吸附功能，蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面，無共價鍵形成，標記后大分子物質活性不發生改變。

3、膠體金的示蹤原理

金顆粒具有高電子密度的特性。金標蛋白在相應的配體處大量聚集時，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒或肉眼可見紅色或粉紅色斑點。

免疫金銀染色：利用金顆粒可催化銀離子還原成金屬銀這一原理，通過銀顆粒的沉積，在光鏡下可見抗原抗體反應的陽性部位呈現銀的黑褐色。

二、膠體金的制備

1、膠體金制備的注意事項

（1）玻璃容器的清潔：玻璃容器應絕對清潔，用前酸洗、硅化。

（2）試劑、水質：實驗用水一般用雙蒸水。緩沖液有足夠大的緩沖容量，濃度不應過高以免金溶膠自凝。

2、常用方法

一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、白磷。

（1）檸檬酸三鈉還原法：

取0.01％氯金酸水溶液100 ml加熱至沸，攪動下準確加入１％檸檬酸三鈉水溶液0.7 ml，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內變為紫紅色，繼續煮沸15分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復到原體積，如此制備的金溶膠其可見光區最高吸收峰在535 nm，Ａ1 cm/535 nm=1.12。

100 ml氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對金溶膠粒徑的影響：

１％檸檬酸三鈉（ml ）0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00

金溶膠顏色                   藍灰 紫灰  紫紅 紅   橙紅  橙

吸收峰(nm)                    220   240    535   525   522   518

徑粒(nm)                        147   97.5   71.5   41   24.5   15

（2）檸檬酸三鈉－鞣酸混合還原劑：改變鞣酸的加入量，制得不同大小的膠體顆粒。

（3）白磷還原法：制備的膠體金直徑約6 nm，并有很好的均勻度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般實驗室不宜采用。

三、免疫膠體金的制備

1、制備膠體金標記蛋白質應注意的問題

（1）蛋白質的預處理。蛋白質應先對低離子強度的水透析，去除鹽類成分。用微孔濾膜或超速離心除去蛋白質溶液中的細小微粒。

（2）低鹽濃度的緩沖液。過量鹽可使金顆粒發生凝集。

（3）PH接近于蛋白質等電點或略偏堿性。蛋白質所處溶解狀態最適合偶聯，蛋白質分子在金顆粒表面的吸附量最大。

（4）蛋白質最適用量的選擇：能使膠體金穩定的最適蛋白量再加10％即為最佳標記蛋白量。

（5）膠體金與蛋白質偶聯后，加入穩定劑，以避免產生凝集。一般選用PEG（分子量為20000）和牛血清白蛋白作穩定劑。

2、常見方法

（1）用0.1 mol/L K2CO3或0.1 mol/L HCl調節金溶膠至所需pH。

（2）加入最佳標記量的蛋白質溶液，攪拌2～3分鐘。

（3）加入5 ml 1％PEG20000 溶液。

（4）于10000～100000 g離心，小心吸去上清液。

（5）將沉淀懸浮于一定的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復，濃度以Ａ1 cm/540 nm=1.5左右為宜，置4 ℃保存。

 四、免疫膠體金的應用

1、膠體金在光鏡水平、電鏡水平的應用

直徑為3～15 nm膠體金均可用作電鏡水平的標記物。最大優點是可以通過應用不同大小的顆粒進行雙重或多重標記。

膠體金用于光鏡水平、電鏡水平的研究，主要包括：①細胞懸液或單層培養中細胞表面抗原的觀察。②單層培養中細胞內抗原的檢測。③組織切片中抗原的檢測。

2、膠體金在流式細胞儀中的應用

應用膠體金標記的抗體，分析細胞表面抗原。膠體金可以明顯地改變紅激光散射角，區分不同的標記，能同時進行幾種標記。

3、凝集試驗

單分散的免疫金溶膠清澈透明。與相應抗原或抗體發生專一性反應后出現凝聚，溶膠顆粒增大、沉降，光散射隨之發生變化，溶液的顏色發生變化。

4、免疫印跡技術

用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質分離，得到的區帶轉移至硝酸纖維素膜，與特異性的抗體保溫后，再與膠體金標記物溫育，根據膜上膠體金顆粒顏色深淺可測知樣品中的特異性抗原。金免疫印跡技術有相當高的靈敏度。采用免疫金銀染色法，靈敏度可低至0.1 ng。

5、膠體金在肉眼水平的應用--膠體金免疫結合試驗

根據檢測裝置的不同可分為金免疫層析試驗和金免疫滲濾試驗。

1、金免疫層析試驗

（1）免疫層析條的組成，有4個組分：⑴吸水紙（加樣區）。⑵玻璃纖維膜，膜上吸附著干燥的金標抗體（流動帶）。⑶硝酸纖維素膜，膜上包被著抗原或抗體條帶和能與標記物直接起反應的質控物條帶（檢測帶）。⑷吸水紙。以上各組分首尾互相銜接。

（2）免疫層析條制作中須注意的幾個問題

微孔濾膜：硝酸纖維素膜有2個特性：較高的蛋白吸附容量和良好的親水性，應用最多。硝酸纖維素膜的活化：先使硝酸纖維素膜上形成氨基手臂，然后再加入戊二醛在手臂上形成自由醛基，多肽與活化膜的活性基團共價聯接。

受體：①與膜材料的結合穩定。②有較高的生物活性，因而有足夠的配體捕獲容量。③有較高的純度，以保證檢測的特異性。④可流動性。標記或非標記受體以干態吸附于流動帶，在流動帶加入高效助溶劑，從而使受體具有快速溶解的特性。

（3）反應模式有夾心法、間接法、競爭法

例1 金免疫層析法檢測嗎啡（競爭法）：

嗎啡是鴉片類鎮痛藥，抑制中樞神經系統。是可待因和海洛因的主要代謝物質，嗎啡不經代謝即可排泄。

測定原理：嗎啡偶聯物和膠體金標記的抗嗎啡單克隆抗體固定于膜上測試區。通過嗎啡偶聯物和尿液中的嗎啡競爭結合金標單克隆抗體，最小檢出量300 ng/ml。

結果判定：

陽性（+）：嗎啡300 ng/ml以上，質控區出現一條紫紅色條帶，測試區內不出現紫紅色條帶。嗎啡濃度高于300 ng/ml時，膠體金抗體與嗎啡全部結合，從而不與嗎啡偶聯物結合而不出現紫紅色條帶。陰性（-）：嗎啡在300ng/ml以下。出現兩條紫紅色條帶，一條在測試區內，另一條在質控區內。嗎啡濃度低于300ng/ml時，膠體金抗體不能與嗎啡全部結合。這樣，膠體金抗體在層析過程中會被固定在膜上的嗎啡偶聯物結合，測試區內會出現一條紫紅色條帶。無效：質控區未出現紫紅色條帶，表明不正確的操作過程或試劑盒已變質損壞。

質控區 測試區 流動帶

二抗 嗎啡偶聯物 金標單抗

例2 金層析免疫法測定甲胎蛋白（夾心法）：

甲胎蛋白（AFP）是原發性肝癌的腫瘤標示物，對肝癌的早期診斷、早期治療具有重要臨床意義。AFP單抗A、B，羊抗鼠二抗固定于硝酸纖維素膜上，金標AFP單抗C固定于玻璃纖維素膜上。陰性1條帶，陽性2條帶， 3條帶為強陽性，不出現有色條帶為試劑失效。

質控帶 陽性 陽性 流動帶

羊抗鼠二抗 單抗A 單抗B 金標單抗C

例3 金免疫層析法檢測梅毒抗體（間接法）：

膠體金標記的抗人IgG，樣品中的梅毒抗體與膠體金標記的抗人IgG結合，沿硝酸纖維素膜移動，在包被有基因重組的梅毒螺旋體抗原結合，出現紅色反應線。

質控帶 陽性 流動帶

抗原 金標抗人IgG

2、金免疫滲濾分析

（1）試劑盒：滲濾裝置為一充滿吸水墊料的塑料小盒，在盒蓋中央的小孔下面放置了一片硝酸纖維素膜，膜上預包被抗原或抗體斑點。

（2）反應模式：間接法、夾心法、捕獲法、競爭法。

間接法：抗原固定于膜上→標本（抗體），洗滌→金標二抗。

夾心法：抗體A固定于膜上→標本（抗原）→金標單抗B。

捕獲法：在固相載體上包被二抗→樣品（待測抗體）→抗原→金標單抗。

競爭法：在載體上包被抗體→加入待測抗原→加入標記抗原

3、金免疫層析分析和金免疫滲濾分析的比較

（1）相同點：檢測原理相同。以微孔濾膜為載體，濾膜的毛細管作用促進抗原抗體結合反應，通過膠體金結合物達到檢測目的。

（2）不同點：

硝酸纖維素膜的種類、形式及組成方式。金免疫層析分析為狹長形膜，由4部分組成，依次是吸水紙、玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜、吸水紙。金免疫滲濾分析為圓形硝酸纖維素膜及底層的吸水墊料。

標記配體的形式。金免疫層析分析為固相形式，金免疫滲濾分析為液相形式。

液體的移動方向。金免疫層析分析是通過層析作用的橫向流動，金免疫滲濾分析是通過垂直穿透固定有配體的硝酸纖維素膜而進行。

操作步驟。金免疫層析分析大多只有加樣一個步驟；金免疫滲濾分析有加樣、洗滌、加標記配體等。

4、金免疫層析分析和金免疫滲濾分析特點

（1）單份測定，試劑和樣本用量極小，樣本量可低至1～2ul。

（2）不需任何檢測儀器，適于現場應用。

（3）沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質參與。

（4）實驗結果可以長期保存。

（5）檢測速度快，幾分鐘即可用肉眼觀察結果。

5、膠體金免疫結合試驗在臨床檢驗中的應用

主要用于檢測正常體液中不存在的抗原性物質、正常人含量極低而在特殊情況下異常升高的物質。

（1）激素。早早孕診斷試劑人絨毛膜促性腺激素，檢測尿液。

（2）傳染病病原的抗原和抗體。肝炎病毒、艾滋病病毒抗體等。

（3）性病病原：梅毒螺旋體抗體、淋球菌等。

（4）細菌：結核桿菌抗體、胃幽門螺桿菌抗體等。

（5）寄生蟲：弓形蟲抗體、血吸蟲抗體等。

（6）腫瘤標記物：前列腺癌特異抗原（消化道惡性腫瘤尤其是結腸癌）、甲胎蛋白（肝癌）

（7）心血管病檢測標志物：血清心肌肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激酶同工酶，診斷急性心肌梗塞。

（8）其他蛋白質：甲狀腺微粒體抗體（橋本甲狀腺炎）

（9）其他：血糖、尿糖及尿液中嗎啡和海洛因等。

6、金免疫結合試驗的發展前景

（1）進一步提高檢測靈敏度。采用信號放大系統如生物素親和素系統或免疫金銀染色法，并結合一些相應的簡單檢測儀器。

（2）實現檢測多元化。在同一膜上作多種項測定，檢測某些具有聯檢意義的物質。

（3）實現定量或半定量檢測。

GIFA可用反射光密度計對斑點顏色的強度進行測定，可得到半定量的結果；控制受體捕獲量：固定多種不同量的受體，在膜上包被多條反應線，觀察各自顯色情況，將待測物含量確定于某一濃度區間。

（4）通用試劑的應用。

膠體金標記葡萄球菌蛋白A代替抗人IgG標記物；鏈親和素可作為通用固定受體，與各種生物素化抗體結合用于檢測相應的抗原性物質。