進入21世紀，隨著蛋白質組學的研究深入，對于多肽化學的要求不僅僅是合成方法，而更多的集中在多肽標記與修飾方法，以及蛋白結構與功能模擬多肽的合成以及長肽或蛋白合成。

• 多肽化學合成的基本介紹

多肽化學合成方法，包括液相和固相兩種方法。液相合成方法現在主要采用BOC和Z兩種保護方法，現在主要應用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催產素等，其相對與固相合成，具有保護基選擇多，成本低廉，合成規模容易放大的許多優點。與固相合成比較，液相合成主要缺點是，合成范圍小，一般都集中在10個氨基酸以內的多肽合成，還有合成中需要對中間體進行提純，時間長，工作量大。固相合成方法現在主要采用FMOC和BOC兩種方法，它具有合成方便，迅速，容易實現自動化，而且可以比較容易的合成到30個氨基酸左右多肽。
1.1．氨基酸保護基 
20種常見氨基酸，根據側鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基側鏈氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），堿性側鏈氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亞氨型基酸（Pro）。多肽化學合成中氨基酸的保護非常關鍵，直接決定了合成能夠成功的關鍵。因為常見的20中氨基酸中有很多都是帶有活性側鏈的，需要進行保護，一般要求，這些保護基在合成過程中穩定，無副反應，合成結束后可以完全定量的脫除。合成中需要進行保護的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要進行保護的基團：羥基，羧基，巰基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保護，因為吲哚性質比較穩定。當然在特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護，象，Asn，Gln ，Thr，Tyr。 
表1 常見3種氨基脫除條件

 

圖1 常見3種氨基保護基結構
氨基酸側鏈保護基團非常多，同一個側鏈有多種不同的保護基，可以在不同的條件下選擇性的脫除，這點在環肽以及多肽修飾上具有很重要的意義。而且側鏈保護基和選擇的合成方法有密切的關系，液相和固相不一樣，固相中BOC和FMOC策略也不一樣，從某種意義上看，多肽化學就是氨基酸保護基的靈活運用與搭配。關于側鏈保護基的使用，請參考王德心的《固相有機合成——原理及應用指南》第四章，我們這里主要介紹Cys，Lys，Asp的幾種保護基及其脫除方法。Cys最常見的保護基有三種，Trt，Acm，Mob，這三個保護基可以完成多對二硫鍵多肽的合成。Lys最常見的保護基有：Boc，Fmoc，Trt，Dde，Allyl，這對于固相合成環肽提供了很多正交的保護策略。Asp最常見的保護基有：Otbu，OBzl，OMe，OAll，OFm，同樣也提供了多種正交的保護策略。
表2 巰基常見保護基

簡稱	結構	脫除條件
Trt		TFA，HCl/HOAc，I2/MeOH
Acm		I2/MeOH，Hg2+
Mob		HF，TFMSA，Hg2+

表3 氨基常見保護基

簡稱	結構	脫除條件
Trt		TFA，HOAc，HCOOH
Boc		HCl/HOAc，TFA/DCM
Fmoc		Pip/DMF，NaOH/MeOH
Dde		H2NNH2/DMF
Allyl		Pd（Ph3P）4，嗎啉/THF

表3 羧基常見保護基

簡稱	結構	脫除條件
Otbu		TFA，HOAc，HCOOH
OBzl		H2/Pd，HF，TFMSA
OMe		NaOH/MeOH
OAll		Pd（Ph3P）4，嗎啉/THF
OFm		Pip/DMF，DBU/DMF

1.2．多肽縮合試劑 
目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法來完成接肽反應，最早使用的是將氨基酸活化為酰氯，疊氮，對稱酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋，以及反應試劑危險以及制備比較復雜，逐漸被后來的縮合試劑取代，按照其結構可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）。 
1.2.1．碳二亞胺型 
主要包括：DCC，DIC，EDC.HCl等。采用DCC進行反應，由于反應中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，產生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其價格便宜，在液相合成中，可以通過過濾除去，應用仍然相當廣泛。EDC.HCl因為其水溶解性的特點，在多肽與蛋白的連接中使用比較多，而且也相當成功。但是該類型的縮合試劑的一個最大的缺點，就是如果單獨使用，會有比較多的副反應，但是研究表明如果在活化過程中添加HOBt，HOAt等試劑，可以將其副反應控制在很低的范圍。其反應機理如下： 

圖2  DIC活化反應機理 
1.2.2．鎓鹽型 
鎓鹽型縮合試劑反應活性高，速度快，現在使用非常廣泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。該試劑使用過程中需要添加有機堿，如，二異丙基乙胺（DIEA），N-甲基嗎啉（NMM），該試劑加入后，才能活化氨基酸。其反應機理如下： 

圖3  TBTU活化反應機理 
1.3．多肽合成方法比較 
1.3.1．液相多肽合成（solution phase synthesis） 
液相多肽合成現在仍然廣泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成規模大，合成成本低的顯著優點，而且由于是在均相中進行反應，可以選擇的反應條件更加豐富，象一些催化氫化，堿性水解等條件，都可以使用，這在固相中，使用卻由于反應效率低，以及副反應等原因，無法應用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應策略。 
 

 

圖4液相合成Glu-Trp 
1.3.2．固相多肽合成 
 

 

圖5  FMOC固相合成Glu-Trp
固相多肽合成現在使用的主要有兩種策略：BOC和FMOC兩種。BOC方法合成過程中，需要反復使用TFA脫BOC，而且在最后從樹脂上切割下來需要使用HF，由于HF必須使用專門的儀器進行操作，而且切割過程中容易產生副反應，因此現在使用受到實驗條件限制，使用也逐漸減少。FMOC方法反應條件溫和，在一般的實驗條件下就可以進行合成，因此，也得到了非常廣泛的應用。 
1.3.2.1．固相合成中常用樹脂 
固相合成中樹脂，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150μm，交聯度在1-2%之間，現在使用的大多是1%，因為這種交聯度下，樹脂在DMF，DCM中具有很好的溶脹性能，立體上是一個空間網狀結構，反應物分子可以在樹脂內部自由移動。樹脂中最關鍵的部分是連接手臂，它一端連接在樹脂上，一端作為反應位點。目前廣泛使用的樹脂有：PAM，MBHA，Wang，2-Cl-Trt，Rink-Amide-MBHA等。其中PAM，MBHA是用在BOC策略中，因為其對酸非常穩定，需要在HF，TFMSA等強酸條件下才能夠切割下來。 
 

 

圖6  固相合成常用樹脂
1.3.2.2．茚三酮檢測 
固相多肽合成中，主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測方法稱為Kaiser方法，其檢測結果，如果有游離氨基的時候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。 
Kaiser試劑包括： 
A，6% 茚三酮的乙醇溶液 
B，80% 苯酚的乙醇溶液 
C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液 
配制中的吡啶需要經過茚三酮處理后，重蒸后再使用。檢測過程，取少量樹脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹脂出現蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接完全。
還有其它檢測游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等。 

圖7 茚三酮檢測原理 
1.3.2.3．固相合成切割方法 
固相合成完成之后，必須選擇合適的切割試劑將多肽從樹脂上切割下來，然后經過冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，經過HPLC分離純化，冷凍干燥得到最后產品。由于選擇的樹脂不同，氨基酸序列不同，在切割時候，選擇的切割方法也不完全相同，一般都是選擇酸性條件下切割的條件，對于PAM，MBHA樹脂，一般采用HF切割，切割過程中需要添加對甲苯酚，對巰基苯酚，苯甲醚等試劑。而對于Wang，Rink-Amide，Trt樹脂，一般采用TFA切割，切割過程中加入，乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三異丙基硅烷，苯酚等。這些添加試劑主要作為碳正離子俘獲試劑使用，目的是俘獲切割反應過程中生成的碳正離子，減少這些碳正離子對部分氨基酸側鏈的進攻導致的副反應，比較容易產生副反應的氨基酸有：Trp，Tyr。切割試劑用量一般10-15ml/g樹脂。常用的切割配比：HF/p-cresol/p-thiocresol（90/5/5），TFA/TIS/EDT/H2O（94/1/2.5/2.5），反應一般是在室溫條件下2h-4h。 
1.3.3．多肽合成中主要問題 
1.3.3.1．消旋及其反應機理 
多肽合成過程中，部分氨基酸在活化的過程中會導致不同程度的消旋，特別容易消旋的氨基酸有：Cys，His，Phe，當然這些消旋化還和溶劑，溫度以及合成中的有機堿等因素有關。對于這些氨基酸，可以通過采用高效縮合試劑，減少反應時間，可以減少消旋的比例，一般條件選擇適當，消旋化都可以控制在5%以內。消旋反應機理如下： 

圖8 消旋反應機理 
1.3.3.2．二酮哌嗪（DKP）反應 
DKP副反應出現在FMOC-Wang樹脂合成過程中，主要出現在第一個氨基酸為Pro的時候，當第二個氨基酸脫FMOC的時候，α-氨基被游離出來之后，立即對Wang樹脂的芐酯鍵進行分子內胺解，生成六元環二酮哌嗪衍生物，同時從Wang樹脂上釋放出來，導致反應終止。該反應非常迅速，文獻報道采用50%Pip/DMF，脫1min，4min的條件，但是我們實驗證明在多數情況下，即使是1min左右反應就超過了20%。因此一般在末端第一個氨基酸為Pro的時候，建議采用2-Cl-Trt樹脂合成，由于該樹脂巨大的空間阻力，可以完全消除該副反應。這個副反應在BOC策略合成過程中，卻可以完全避免，因為BOC在使用TFA脫除后，使氨基以TFA鹽的形式存在，從而失去了親核性，不能進攻芐酯鍵。 

圖9  DKP反應機理
1.3.3.3．困難序列多肽合成
固相多肽合成中也經常遇到多肽合成失敗或合成效率很低的問題，這里面的主要原因是由于多肽序列引起的，因為有些多肽序列在樹脂上形成β-折疊，改變了樹脂的溶脹性能，還有可能將反應的活性位點埋藏在樹脂里面，這樣使得反應很難進行，目前報道使用的主要方法有：

• 使用混合溶劑，DMSO/DMF，6N 胍啶/DMF溶液
• 提高反應溫度，或采用微波方法
• 使用高離液鹽，LiCl，NaClO4等。
• 使用溶脹性能更好的PEG-PS樹脂，同時減少樹脂擔載量（0.05-0.2mmol/g）

1.4．合成多肽分析鑒定方法 
多肽的分析鑒定方法有多肽一級結構，二級結構鑒定，多肽一級結構包括：質譜分析，氨基酸組成分析，氨基酸序列分析。二級結構包括：圓二色譜（CD），NMR，X-衍射等方法。 
1.4.1．純度分析 
多肽的純度分析，一般都采用HPLC進行分析，選擇RP-C18，粒徑5μm，孔徑300A，4.6×150mm，流動相：A，0.1% TFA/H2O；B，0.1% TFA/ACN，洗脫梯度，5%B--65%B，時間30min。也有些多肽，特別是短肽，由于親水性強，在C18上保留很弱，需要改變條件，這里主要有兩種方法：一個改變分析梯度，可以將起始梯度改為2%，等度或小梯度洗脫；另外一個方法是在流動相中加入強離子對試劑，如七氟丁酸，十八烷基磺酸鈉等。 
1.4.2．一級結構分析 
1.4.2.1．質譜分析 
質譜分析的目的主要是確證分子量，當然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息，但是這個需要比較全的數據庫作為基礎，分析才能比較準確。由于多肽性質不穩定，需要采用軟電離技術，目前多肽分析主要使用了電噴霧（ESI-MS），基質輔助激光解吸（MALDI-MS）。其中ESI-MS通常會給出多電荷峰，電荷數目和多肽序列上氨基，胍基，咪唑基的數目有關，因此，經常給出了雙電荷，三電荷等離子峰。MALDI-MS可以分析蛋白大分子，而且通常情況下很少帶多電荷，因此數據直接對應了分子離子峰，容易分析。此外，通常在分析長肽或蛋白過程中，需要添加NH4，Na，K等離子，提高靈敏度，所以一般在MS中出現一組峰，分別對應：（M+H）+，（M+NH4）+，（M+Na）+，（M+K）+。 
1.4.2.2．氨基酸組成分析 
氨基酸組成分析一般需要產品的純度較高，它可以給出多肽中氨基酸的種類，數目。分析過程首先通過酸水解破壞肽鍵，典型酸水解的條件是：真空條件下，110℃，用6M鹽酸水解16至72小時。酸水解雖然很有用，但酸水解條件下不能獲得完整的氨基酸分析，因為天冬酰胺和谷氨酰胺的側鏈含有酰胺鍵，用于切斷蛋白質肽鍵的酸也可以將天冬酰胺轉換為天冬氨酸，谷氨酰胺轉換為谷氨酸。由于水解溫度比較高，色氨酸的吲哚環容易被空氣氧化，即使在密封的管中，色氨酸的吲哚環也幾乎都被破壞了。因此蛋白質的色氨酸含量往往是通過它的紫外吸收光譜估計的，也可以通過堿水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能精確測定，要精確測量需要在蛋白質水解之前進行氧化或羧甲基化，形成的衍生物在酸水解之后才能定量。 
1.4.2.3．氨基酸序列分析 
氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，主要涉及耦聯、水解、萃取和轉換等4個過程。首先使用苯異硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的堿性條件下對蛋白質或多肽進行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸處理，N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下來將該衍生物用有機溶劑（例如氯丁烷）從反應液中萃取出來，而去掉了一個N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩定，經酸作用，再進一步環化，形成一個穩定的苯乙內酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。留在溶液中的減少了一個氨基酸殘基的肽再重復進行上述反應過程，整個測序過程現在都是通過測序儀自動進行。
1.4.3．二級結構分析 
1.4.3.1．圓二色譜（CD） 
圓二色譜是一種特殊的吸收譜，它通過測量蛋白質等生物大分子的圓二色光譜，從而得到生物大分子的二級結構，簡單、快捷，廣泛應用在蛋白質折疊，蛋白質構象研究，酶動力學等領域。圓二色譜紫外區段（190-240nm），主要生色團是肽鏈，這一波長范圍的CD譜包含了生物大分子主鏈構象的信息。α-螺旋構象的CD譜在222nm、208nm處呈負峰，在190nm附近有一正峰。β-折疊構象的CD譜，在217-218nm處有一負峰，在195-198nm處有一強的正峰。無規則卷曲構象的CD譜在198nm附近有一負峰，在220nm附近有一小而寬的正峰。 
1.4.3.2．核磁共振(NMR)
隨著二維、三維以及四維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發展，使NMR逐漸成為大分子結構物質分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列、分布以及構象。目前，NMR在分析分子中含少于30個氨基酸的小肽時是非常有用的，分析結果快速準確。
1.4.3.3．X-衍射 
X-衍射可獲得有關化合物晶型的直接信息，而且可以判斷相對與絕對構型。

• 多肽標記及修飾

目前多肽標記及修飾的內容非常多，廣泛應用在多肽藥物，多肽生物學，多肽抗體以及多肽試劑的研究中。目前應用廣泛的有：非放射性核素標記（C13，H2），熒光標記（FAM，FITC），生物素標記，磷酸化修飾等。 
2.1．非放射性核素標記 
目前在非放射性核素標記中，使用廣泛的仍然是C13，H2，因為其使用安全，放射性小。現在有比較完全的非放射性標記的氨基酸，可以按照正常的多肽合成方法將標記好的氨基酸直接連接到多肽上。 
2.2．熒光標記 
熒光標記由于沒有放射性，實驗操作簡單。因此，目前在生物學研究中熒光標記應用非常廣泛，熒光標記方法與熒光試劑的結構有關系，對于有游離羧基的采用的方法與接肽反應相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。但是對于FITC標記，需要在連接FITC前，增加一個氨基己酸，避免在切割的過程中被TFA切割掉。 
2.3．生物素標記 
生物素-親合素系統 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期應用于免疫學，并得到迅速發展的一種新型生物反應放大系統。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應，并與熒光素、酶、同位素等免疫標記技術有機地結合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高。主要有用于標記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)和生物素對硝基酚酯(pBNP)，其中以BNHS最常用，當然，也可以直接使用生物素也可以標記，因為其結構上有個游離的羧基，采用HBTU/HOBt/DIEA方法縮合，由于生物素的溶解度低，使用DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。 
2.4．磷酸肽合成 
磷酸肽在生命過程中發揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser，Thr，Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸，Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用該方法合成磷酸化也有缺點，特別是在合成多磷酸化多肽或長肽的時候，連接效率低，最后產品純度很低，對于這種磷酸化多肽，我們考慮采用后磷酸化方法，其合成過程就是在多肽合成結束后，選擇性脫去要標記的氨基酸的側鏈保護基，對于Tyr，Thr可以直接使用側鏈不保護的氨基酸進行反應，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后磷酸化，采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，隨后在過氧酸下氧化生成磷酰基，完成反應。

• 蛋白結構與功能模擬多肽

多肽在與蛋白受體結合發揮功能的時候，總是先折疊出某些特殊的結構，多肽類似物合成主要是為了模擬這些結構，保持或提高生物活性，同時也為了改變多肽的穩定性，提高其抗酶解能力。 
3.1．α-螺旋多肽 
α-螺旋是蛋白結構中最為普通的一種，但是一般多肽在溶液中大多是無規卷曲的，目前使用最多的方法是多肽保持α-螺旋結構就是在多肽表面通過共價鍵將處在α-螺旋結構的兩個氨基酸連接起來，選擇的位點（i，i+4或i，i+7），選擇的化學鍵包括：二硫鍵，硫醚鍵，酰胺鍵，烯烴鍵（RCM）等方法。 
3.1.1．二硫鍵 
二硫鍵廣泛存在與蛋白結構中，對穩定蛋白結構具有非常重要的意義，二硫鍵一般是通過序列中的2個Cys的巰基，經氧化形成。形成二硫鍵的方法很多：空氣氧化法，DMSO氧化法，過氧化氫氧化法等。二硫鍵的合成過程，可以通過Ellman檢測以及HPLC檢測方法對其反應進程進行監測。 
3.1.2．硫醚鍵 
硫醚鍵的形成可以通過序列中的Lys，將溴乙酸連接到Lys的側鏈氨基上，利用其和巰基的特異性反應，反應在緩沖溶液中進行，迅速高效。 
3.1.3．酰胺鍵 
多肽的內酰胺環肽的合成一般是利用Lys，Asp（Glu）的選擇性保護，在固相上直接環化。BOC策略中可以采用BOC-Lys（Fmoc），BOC-Asp（OFm），FMOC策略中可以采用FMOC-Lys（Aloc），FMOC-Asp（Allyl）。對于首尾環肽，還可以先合成保護的多肽，然后在液相中環化生成目標多肽。 
3.1.4．烯烴鍵（RCM） 
RCM反應是一個過渡金屬催化反應，其反應中使用催化劑：(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh，可以催化烯烴環化，過程中脫去一分子乙烯。 

圖10  固相RCM反應 
該反應也可以在固相樹脂上直接環化,反應條件：15-25% (Cy3P)2Cl2Ru=CHPh DCM,60-80℃，24-48h。 
3.2．TASP（template-assembled synthetic peptide）多肽 
瑞士Basel大學的化學家首次提出TASP的概念，他們利用具有“發夾”結構的肽鏈作為模板，然后將具有α-螺旋結構的多肽直接連接到模板上，模擬蛋白質的高級結構。 
3.3．長肽或蛋白合成 
3.3.1．FMOC-tbu片段縮合方法
FMOC-tbu片段縮合方法在合成長肽以及蛋白上面運用非常廣泛，其合成過程首先是合成保護性肽片段，經過純化后，將幾個片段在液相或固相上組裝起來。使用本方法主要注意幾個方面：片段的選擇，片段的合成與純化，片段縮合方法。片段選擇要考慮到片段連接反應時間長，容易導致消旋，故片段的C末端最好選擇Gly，Pro。合成的片段一般需要經過C4，C8等純化，對于溶解性很差的多肽，可以采用硅膠柱層析方法進行純化。由于片段的分子大，在樹脂內移動速度慢，故反應時間一般都很長，而且反應過程中與片段濃度關系很大，溶解的時候，盡量提高片段的濃度。對多種條件的選擇，發現采用DMF為溶劑，DIC/HOBt的方法縮合效率最高，消旋也最小。

圖11 FMOC-tbu片段縮合示意圖
3.3.2．自然化學連接（Native Chemical Ligation）
自然化學連接方法的優點是可以采用完全脫保護的多肽，因此不存在溶解性問題，其反應也是在緩沖水溶液中進行，由于其利用的是巰基和硫酯的特異性反應，再經過由S到N的轉變完成肽鍵的合成。 

圖13自然化學連接
總之，今后多肽化學的研究，不僅是將更多的有機化學合成新方法，新技術引入到多肽研究當中，而且對蛋白的結構以及功能模擬，開展結構活性研究（structure activity relationship）將是研究開發的熱點，因為這將為揭示蛋白的內在的生物活性本質提供大量實驗數據。