1、根據樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據材料不同適當加入），準備提取液放在冰上。

2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時）。

3、用離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

4、提取上清夜，樣品制備完成。

蛋白質提取液：300ml

1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml

2、甘油（Glycerol）75ml

3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g

這種方法針對SDS-PAGE，垂直板電泳！

 

三氯醋酸—丙酮沉淀法

1、在液氮中研磨葉片

2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜，然后離心（4℃8000rpm以上1小時）棄上清。

3、加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），搖勻后離心（4℃8000rpm以上1小時），然后真空干燥沉淀，備用。

4、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心（15℃8000rpm以上1小時或更長時間以沒有沉淀為標準），可臨時保存在4℃待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃備用。

藥品：

提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮

裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

這種方法針對雙向電泳，雜質少，離子濃度小的特點！當然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會減少！

 

3、組織：腸黏膜

目的：WESTERN BLOT檢測凋亡相關蛋白的表達

應用TRIPURE提取蛋白質步驟：

含蛋白質上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）

倒轉混勻，置室溫10min

離心：12000 g，10min，4度，棄上清

加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）

振蕩，置室溫20min

離心： 7500g，5 min，4度，棄上清

重復0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次

沉淀中加入100％乙醇 2ml

充分振蕩混勻，置室溫20 min

離心： 7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀

1％SDS溶解沉淀

離心：10000g，10min，4度

取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）

存在的問題：加入1％SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了白色沉定，SDS結晶？測濃度，含量才1mg/ml左右。

解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分鐘，效果很好的。

 

1、200毫克樣品置于冰上磨碎

2、加lysis buffer，離心，10000rpm，4度，5min取上清

3、重復離心5min

lysis buffer：urea   np-40  ampholine 2-me  pvp-40

 

秧苗蛋白質樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進行。

100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巰基乙醇），混勻，-20℃沉淀1小時，4℃，15000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀復溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇)，再于-20℃沉淀1小時，同上離心棄上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。

按每mg干粉加入20μl（可調） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫蘇糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃溫育30min，期間攪動幾次，28度 （溫度低，高濃度的尿素會讓溶液結冰）16000 r/min離心15 min，離心力越大時間長一點越好！上清即可上樣電泳。或者-70度保存

 

(1) sample, 液氮研磨

(2) 裝1.5 ml centrifuge 用tube

(3) 加 1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul

(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite

(5) 取上層液，蛋白質就在里面