一、驗證方案的起草與批準

    1.驗證方案起草

      起草人：       起草時期：

    2.驗證小組成員：

    3.驗證方案審核

    4.驗證方案批準

      批準人：       批準日期：

二、驗證方案

    1.驗證目的和原理

    1.1驗證目的

       為確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌、酵母菌數的測定，特制定本方案。驗證過程應嚴格按照本方案規定的內容進行，若因特殊原因確需要變更時，應報驗證委員會批準。

    1.2原理

       通過比較試驗4組中試驗菌的恢復生長結果來評價整個檢驗方法的準確性、有效性和重現性。

    2.驗證方法步驟

    2.1驗證前的準備：進行微生物限度檢查方法（薄膜過濾法）驗證前，所有的平皿和稀釋劑都應該嚴格

       按照相關的滅菌程序消毒，以確保其對試驗的結果沒有影響。試驗菌應包括G—、G+、酵母菌和霉菌類微生物以基本覆蓋樣品中可能存在的微生物。

    2.2驗證試驗的操作計劃：用3個不同批號產品微生物限度檢測方法進行平行試驗，通過計算回收率來判斷限度檢查方法是否對產品有影響。

    2.3試驗結果可接受標準：用標準菌株評價方法“ ”的微生物限度檢查對檢品中微生物的抑制性，試驗結果應顯示3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率應不小于70%，試驗組回收率也不低于70%。

    3.試驗實施

    3.1試驗前的準備

    3.1.1主要儀器設備：恒溫培養箱、生化培養箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌器、凈化工作臺。

    3.1.2操作環境：操作間應該安裝空氣除菌過濾層裝置。環境潔凈度不應低于10000級，局部潔凈度為100級（或放置同等級凈化工作臺）。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應該保持對環境形成正壓，不低于4.9pa。

    3.1.3試驗樣品： 

         批號：    批號：      批號： 

    3.1.4培養基：

    3.1.5稀釋液：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液

         以上經115℃高壓蒸汽滅菌30min。

    3.1.6驗證用微生物名稱及其編號

         實驗菌株的來源： 

         編號由菌名首字母—傳代代數—制備日期組成。

    3.1.7器具：無菌薄膜過濾器：（孔徑0.45um直徑50mm）、無菌移液管（5ml）

    4.驗證方法

    4.1菌液的制備

       將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種至10ml的無菌營養肉湯中在30～35℃下培養18～24小時，將白色念珠菌接種至改良馬丁液體培養基中，在23～28℃下培養24～48小時。將黑曲霉接種至改良馬丁液體培養基中，在23～28℃下培養5～7天。將上述培養物用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌落數為50～100cfu的菌懸液。

    4.2實驗方法

       供試液的制備：取樣品10g（ml）加入無菌PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖使分散均勻，用勻漿儀混勻，置45℃水浴使膠囊殼溶化混勻，制成1：10均勻的供試液。

       A.樣品試驗組

       取1:10供試液（相當1g或1ml供試品）10ml，加至100ml稀釋液中混勻，過濾并用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，在*后一次沖洗液中加入50~100cfu菌液，濾完后，將接有細菌的濾膜取出，菌面向上（接觸細菌和樣品的面）貼于已凝固的培養基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養瓊脂培養基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養基平皿上。

       B.菌液組

       取上述制備菌液各1ml加至100ml稀釋液中混勻，過濾并用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，濾完后，將接有細菌的濾膜取出，菌面向上（接觸細菌和樣品的面）貼于已凝固的培養基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養瓊脂培養基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養基平皿上。

       C.供試品對照組

       取上述1：10供試液10ml，加至100ml稀釋液中混勻，過濾并用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，濾完后，將濾膜取出，接觸樣品的面向上貼于已凝固的培養基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養瓊脂培養基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養基平皿上。

       D.稀釋劑對照組

       取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜3次，每次100ml，在最后一次沖洗液中加入50~100cfu菌液，濾完后，將接有細菌的濾膜取出，菌面向上貼于已凝固的培養基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養瓊脂培養基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養基平皿上。

    4.3培養 

       將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在30～35℃下培養48小時，將白色念珠菌、黑曲霉在23～28℃下培養72小時，點計菌落數。

    5.試驗結果

    5.1產品試驗組微生物生長檢查情況： 批號： 

    5.2供試品對照組微生物生長檢查情況： 批號： 

    5.3稀釋劑對照組微生物生長檢查情況： 批號： 

    5.4菌液組微生物生長檢查情況： 批號： 

    6.回收率計算

    6.1稀釋劑對照組菌回收率

       表中：回收率=稀釋劑對照組的平均菌落數÷菌液組的平均菌落數×100%。

    6.2試驗組菌回收率

       表中：回收率=（試驗組的平均菌落數－供試品對照組的平均菌落數）÷菌液組的平均菌落數×100%。

    7.結論：

    7.1經過驗證，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分別為 %、 %、 %、 %、 %。

    7.2稀釋劑回收率為 %、 %、 %、 %、 %。 

       以上驗證結果證明，本品 采用上述方法進行微生物限度檢查。

       檢驗人：          復核人：

    8.驗證結果評價分析

      質控部負責各項驗證、試驗結果記錄，驗證小組根據驗證、試驗結果進行評價，起草驗證報告，報驗證委員會。

      驗證委員會負責對驗證結果進行綜合評審，做出驗證結論，發放驗證證書。對驗證結果的評審應包括：

     （1） 驗證試驗是否有遺漏；

     （2） 驗證實施過程中對驗證方案有沒有修改，修改原因、依據以及是否經過批準；

     （3） 驗證記錄是否完整；

     （4） 驗證試驗結果是否符合標準要求，偏差及對偏差的說明是否合理，是否需進一步補充試驗。

    9.終審批

      驗證報告由驗證組長審核后，報驗證總負責人批準，并簽發驗證證書。

   
驗證報告

      年 月 日至 年 月 日，驗證小組根據批準的微生物限度檢查方法（薄膜過濾法）驗證文件對微生物限度檢查法進行了相關的一系列驗證工作，達到了預期效果，滋將有關事項說明如下：

    1、 驗證方案在實施過程中未做修改。

    2、 驗證方案各項性能指標在驗證中未作變動，誤差在允許范圍內。

    3、 驗證過程中結果符合規定要求，記錄完整屬實。

    4、 驗證結果符合設計要求和GMP原則要求，可以投入使用。

    5、 組分或檢驗條件改變時須重新驗證。

    以上情況，請驗證委員會審批！

    驗證小組：        年 月 日