（1）取樣時該樣品必須是代表該批產品情況。

從車間取回樣品冷凍品按要求進行解凍，干燥食品可放在常溫冷暗處，易腐和冷卻樣品應放入10℃環境。冷凍樣品來不及檢驗應放入-15℃以下冰箱內，待檢樣品存放時間不應超過36h。

（2）解凍

原則上冷凍樣品取出后，按包裝原樣在室溫下自然解凍；也可在0-4℃環境解凍，時間不超過18小時；也可在溫度不超過45℃環境中解凍，時間不超過15min。如果這些解凍條件對有些產品尤其是大塊冷凍品達不到解凍的目的，可參照以下解凍時間。

① 100-300g調理食品45℃解凍10min左右；

② 500g以下冷凍蔬菜30℃解凍40min左右；

③ 500g以上冷凍樣品37℃解凍1h左右；室溫下解凍2h左右。

※ 備注：將樣品解凍到半解凍狀態（用剪刀能剪開的程度）。

（3）操作環境

試驗前用臭氧發生器/紫外線將工器具、無菌間滅菌消毒，達到無菌狀態。

操作試驗的準備物品均質袋、酒精及酒精棉、吸管、平皿、稀釋液、剪刀、鑷子、無菌盆等物品是否齊全。

二、取樣及樣液制備

1 樣品標識

將樣品從污染程度低到污染程度高的順序排列，相應的作一一對應性標識，其中按細菌數平皿、大腸菌群平皿、金黃色葡萄球菌平皿的順序，5-1個樣品一摞。

2 檢樣采取

先將樣品外包裝正反面用酒精噴灑（如果樣品表面有冷凝水先擦拭干凈后再用酒精噴灑）

（1）固體樣品

① 75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀剪開，

② 在電子稱上放入無菌均質袋（手不要碰及袋口）去皮調整至零，

③ 用火焰滅菌后的剪刀和鑷子取樣，稱取25g有代表性樣品，。

④ 加入225mL滅菌磷酸鹽緩沖液（開蓋瓶塞時瓶口部和瓶塞應在火焰通過1-2次，以殺滅從空氣中落入雜菌）后，均質或待均質。

⑤ 擦拭干凈剪刀鑷子后浸泡于75%酒精容器中并將樣品封口。

⑥將袋子折疊后用拍擊式均質器均質約30秒作為樣液，此時均質袋內要設定為不含空氣（可根據樣品不同情況相應調整均質時間）。

（2）液體樣品

①冷凍樣品完全解凍后使用。

②75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀開啟，用滅菌吸管取充分混合后樣25mL。

③余同上。

(3) 粉末狀樣品以及半固體樣品

①將樣品混合均一化。

②75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀開啟，以無菌匙采取混合后樣10g。

③加入90mL滅菌磷酸鹽緩沖液，開蓋瓶塞時瓶口部和瓶塞應在火焰通過1-2次，以殺滅從空氣中落入雜菌。

④余同上。

※ 備注：

（1） 從罐頭取樣時，在表面放上小塊酒精棉（倒上少量酒精）點火燃燒后開罐。罐頭起子用酒精棉擦拭火焰滅菌后使用。

（2） 75%酒精必須保證一周換3次，如果容器內有明顯的污物應立即更換。

（3） 火焰滅菌的剪刀、鑷子通過火焰4-5s即可。

三、稀釋方法

①從均質袋準確吸取樣液1mL，如圖6-1。

②沿管壁徐徐接種到含9mL磷酸鹽緩沖液里，蓋上試管塞后充分震蕩混勻為1：100稀釋液。（勿使吸管尖端伸入稀釋液內，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內。）

③重復該操作，按需要配制1：1000、1：10000…稀釋液。

④為減少樣品稀釋誤差，在連續遞增稀釋時（原液在前稀釋液在后），每一稀釋液應充分振搖，使其均勻，同時每一稀釋度應更換一支吸管

⑤不要在稀釋劑中吹洗吸管。

※ 備注：

（1） 樣液稀釋必須加以足夠震搖，確保液體混勻，形成的菌落能以10倍遞增或遞減，符合邏輯性。

（2） 車間產品根據加工工藝或對污染情況的估計選擇合適的稀釋倍。（尤其注意蔥、姜、蒜等無加熱類產品、保存實驗、外調新廠家、樣品開發、原料等樣品）。

四、樣液接種方法：

① 從吸管筒沿筒上壁抽出吸管，在火焰旁吹洗吸耳球同時在吸管尾端插上吸耳球后，從吸管尾端至尖端快速通過火焰，并且排空吸管里殘留的水。

② 以吸管插入均質袋樣液內的深度不超過2.5cm處，準確吸取樣品勻液（吸管尖不要碰著袋口。吸入的液體應先高于所要求的刻度, 然后提起吸管使其尖端離開液面并貼在袋內將液體調至所要求的刻度。）1mL、1mL、1m、0.2mL無菌操作分別以2～4s內完全注入已標識清楚的細菌數、大腸菌群、EC以及金黃色葡萄球菌平皿中（EC接種后應迅速震蕩均勻）。

③  如果某一樣品液在接種前放置時間超過3 min，應重新均質。

④ 為了驗證稀釋液、培養基、平皿、吸管等器具無菌需做空白對照。

五、傾注倒培養基方法

右手持培養基三角瓶（已放50-60℃的水浴中恒溫）置火焰旁邊，用左手拇指和食指或中指使平皿開啟成一縫，迅速倒人培養基約15mL，加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然后平置于桌面上；也可將平皿放在火焰附近的桌面上用左手的拇指和食指打開培養皿，再注入培養基，搖勻。

※備注：

（1）培養基在50-60℃水浴中的保溫時間不要超過4h。

（2）從采樣開始到分注培養基操作限于20min以內。

（3）涂布的平皿表面需干燥（干燥不充分易發生菌落擴散，有冷凝水不利于細菌分離并且會導致細菌繁殖使結果失真；干燥過分，會導致培養基裂開，不能用；干燥合適，則樣液吸收完全、快）。

（4）細菌容易吸附在玻璃器皿的表面，所以菌液注入平皿后應盡快將平皿內的樣液和瓊脂培養基充分混合，否則細菌不容易分散。混合方法是將平皿傾斜和旋轉使之充分混合，但要注意不要讓培養基從培養皿內溢出，且不要粘附在平皿壁和蓋上。

六、培養

●  平皿倒置放入恒溫培養箱中(每垛最多堆放6個平皿，平皿間要留有空隙進行空氣流通，使培養物的溫度盡快與培養箱溫度達到一致)，按所規定的時間溫度進行培養。培養箱應保持一定的濕度,經48h培養的瓊脂培養基的失重不得超過15％

●  斜面、高層斜面、液體培養基立在試管架上放入恒溫培養箱中，按所規定的時間溫度進行培養

七、計數判定及注意事項

●由于細菌種類繁多，差別甚大。計數時一般用透射光于平皿背面或正面（菌落計數器）仔細觀察。必要時用放大鏡檢查，以防遺漏尤其是平皿邊緣生長的菌落。

●計數方法參照GB 4789.2方法。

●稀釋度低的培養皿，微生物菌落和食品碎渣很難區分，一般以食品碎渣沒有光澤，不夠光滑來識別。

●為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質與細菌菌落發生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經培養，而于4℃環境中放置，以便計數時作對照觀察。

● 必要時，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在平板計數瓊脂中加入氯化三苯四氮唑TTC（100mL加入1mL 0.5%TTC），培養后菌落呈紅色，易于分別。

● 在發酵試驗中，發酵倒管的產氣量，多者可以使發酵倒管全部充滿氣體，少者可以產生比小米粒還小的氣泡，或發酵時產酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡，都應作進一步試驗。如果對產酸但未產氣的發酵有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，就像啤酒中的二氧化碳氣泡一樣，即應考慮可能有氣體產生，而應作進一步試驗。如果只是搖起的氣泡，就是陰性。