在添加有機(jī)相后測(cè)量流動(dòng)相的pH值
在水溶液中,pH值被校準(zhǔn)以提供正確的pH值——你需要確認(rèn)的緩沖液是水溶液。如果你用添加了有機(jī)相的水溶液來測(cè)量pH值,pH值就會(huì)與有機(jī)相添加前的pH值不同。
然而,最重要的一點(diǎn)是要保持一致。如果你總是在添加有機(jī)相后測(cè)量pH值,確保你在方法中說明了這一點(diǎn),以便每個(gè)人都用同樣的方法。它不會(huì)百分百準(zhǔn)確,但至少會(huì)是一致的。這可能比精確的pH值更重要。
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緩沖液是用來控制pH值和抵抗pH值變化的。方法的許多其他部分(例如樣品基質(zhì)、空氣中的二氧化碳、流動(dòng)相中水的來源)可以改變流動(dòng)相的pH值,從而導(dǎo)致保留、峰形和峰值響應(yīng)的變化。甲酸,三氟乙酸等不屬于緩沖試劑。
每個(gè)緩沖鹽有2個(gè)pH值單位范圍,它提供了最佳的pH穩(wěn)定性。在緩沖范圍外面,鹽對(duì)pH值的變化是無效的。要么在正確的范圍內(nèi)使用緩沖區(qū),要么選擇一個(gè)范圍覆蓋所需pH值的緩沖區(qū)。
將水的緩沖液混合到有機(jī)相中,會(huì)導(dǎo)致緩沖液沉淀的高風(fēng)險(xiǎn)——在許多情況下,變化微小,以至于可能不太明顯。常常是將有機(jī)物質(zhì)添加到水相,這大大降低了緩沖沉淀的風(fēng)險(xiǎn)。
現(xiàn)代泵在混合流動(dòng)相和在線脫氣上非常有效,然而,并不是每個(gè)使用你的方法的人都有一個(gè)高質(zhì)量的泵。預(yù)混合你的A和B,混合成一個(gè)單一的溶液,在A管路上100%運(yùn)行。
將950mL的水溶液與50mL的有機(jī)溶液混合,然后過濾和脫氣。這降低了HPLC之間的可變性,降低了系統(tǒng)中氣泡和沉降的風(fēng)險(xiǎn)。
注意,在泵上混合的95:5不會(huì)和在瓶中預(yù)拌的95:5相同的保留時(shí)間——你通常需要在預(yù)混合時(shí)添加更多的有機(jī)成分。
只使用你正在使用的緩沖鹽的酸或堿。舉例來說,磷酸鈉緩沖液應(yīng)該僅用磷酸或氫氧化鈉來調(diào)節(jié)。
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例如,將5g的磷酸鈉放入1000ml的水中
緩沖劑的類型(單鹽基,二鹽基,三鹽基)決定了它的pH緩沖范圍。
所需的質(zhì)量濃度決定了緩沖強(qiáng)度。5g無水磷酸氫鈉和5g一水合磷酸氫鈉會(huì)有不同的緩沖強(qiáng)度,并會(huì)影響到保留。
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如果前一種方法在B管路中使用了緩沖液,而你的方法在B管路中使用了有機(jī)相,那么緩沖液很有可能會(huì)在你的泵管路/泵頭中沉淀。我在早期就這樣做了,并且造成了很大的傷害。如果有懷疑——把它沖出來(用80:20水:有機(jī)相)。
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如果沒有足夠的流動(dòng)相來完成運(yùn)行——將有50%的可能性,氣體將會(huì)在最后幾個(gè)樣品的中運(yùn)行。除了磨損你的泵和色譜柱走干的風(fēng)險(xiǎn),流動(dòng)相從表面蒸發(fā),所以在瓶子頂部的流動(dòng)相與大多數(shù)體積相比成分將會(huì)改變。如果你使用瓶子里的最后少量的流動(dòng)相,頂部的這個(gè)部分恰好是貫穿柱子的東西。
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這對(duì)確保你所有的緩沖鹽溶解都很好,但這是最不有效的脫氣方法,它會(huì)迅速加熱流動(dòng)相,導(dǎo)致有機(jī)部分蒸發(fā)。節(jié)省你日后的問題——用5分鐘的時(shí)間來過濾你的流動(dòng)相——它會(huì)在一個(gè)步驟中脫氣和過濾。
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