六、奶牛胚胎移植產業化的相關技術

    胚胎生物技術是生物技術的重要內容之一，所包括的具體技術內容和研究的熱點很多，有些技術已比較成熟，開始或即將用于胚胎移植產業化的實踐，但尚有很多技術內容仍處于實驗室階段，離實際應用還有相當的距離。
  （一） 、胚胎的冷凍保存
    胚胎冷凍保存的成功使奶牛的胚胎移植不再受時間和空間的限制，完全可以根據受體母牛的發情情況人為確定胚胎移植的時間。其次，使胚胎的國際、國內交換以及長期保存成為可能，大大推動了胚胎移植產業化的進程。
    目前常用的胚胎冷凍方法主要有兩種：
    1、慢性冷凍保存
    此法是將胚胎置于抗凍保護劑溶液中，經緩慢降溫，一般降溫速度為1每分鐘攝氏度到3每分鐘攝氏度，達到一定的溫度后投入液氮（-196攝氏度），即可長期保存。經冷凍保存的胚胎在移植前經解凍進行移植。這種方法由于降溫速度慢，可在胚胎完全凍結前脫出細胞內的水分，防止冰晶形成對胚胎的傷害。整個冷凍過程需要2-4小時，比較費時。目前已有各種類型的胚胎冷凍儀，可以進行電腦程序控制，保證了每一批的冷凍質量。該法已在國內外廣泛應用，成為一種常規的胚胎冷凍保存方法。
    2、玻璃化冷凍保存
    此法是將胚胎置于特制的高濃度的冷凍保護液中，只需要幾分鐘的平衡時間即投入液氮中完成冷凍保存過程。胚胎解凍后的生存能力不低于慢速冷凍保存。此法不需冷凍儀和特殊設備，在沒有實驗室的現場條件下即可操作。由于整個冷凍過程只需幾分種的時間，縮短了操作的時間，具有很好的推廣和應用前景。
  （二） 、體外受精
    奶牛的體外受精是指精子和卵子在體外人為控制的實驗室條件下完成受精的技術，也是奶牛胚胎生產的方式之一，以這種方式得到的胚胎叫體外胚胎。
    目前，進行體外受精的卵子（卵母細胞）有兩種獲取方法：
    1、宰場剛屠宰的母牛體內摘取卵巢，以一定的方法處理后，從卵巢上收集卵母細胞，要求卵泡直徑為3-10亳米。然后將這些卵母細胞在二氧化碳培養箱內培養成熟，再與經獲能處理的公牛精子放在一起完成受精，繼而把受精卵培養至囊胚階段進行移植或冷凍保存。從廢棄的卵巢中采集卵母細胞生產胚胎的方式，材料來源豐富，生產成本低，便于工廠化操作，可做到成批生產的目的。存在問題是母牛的來源及系譜無法確定；其次，這類胚胎移植的受胎率低，應用時應慎重考慮。
    2、從活體母牛卵巢直接收集卵母細胞
    這種方法要借助超聲波探測儀、內窺鏡或腹腔鏡等直接由活體母牛的卵巢上吸取可用的卵母細胞。隨后的體外培養和受精過程與屠宰場獲取的卵巢卵母細胞相同。
    值得注意的是不管采用哪種方法生產的體外胚胎普遍存在活力較低，移植后產犢率低，胎兒初生重高，容易造成母牛難產等實際問題。
  （三） 、胚胎切割
    胚胎切割是指運用顯微鏡操作儀或其他簡單設備將附植前的囊胚期胚胎分割為若干具有繼續發育潛能部分的技術，是提高胚胎利用率的有效方法之一。
    在進行胚胎切割時為了便于操作和切割后的胚胎發育，一般選用發育到桑椹胚或囊胚最為適宜。一般借助微針或微刀對準胚胎內細胞團的部分進行均等的直接下切，以保證切割后的部分有均等的發育能力。從理論上講胚胎的切割可能是無限的，但是實踐證明只有二分胚的發育能力最強。近幾年通過實驗證明，二分胚直接移植的受胚率也可達40%以上，這無異是提高了胚胎利用率，但對這一技術仍需加強研究，簡化操作，提高效率。
    五、胚胎的性別控制
    奶牛的性別控制是指采用某些人為的技術方法控制受精后胚胎性別，這是從根本上控制后代的性別比例，又稱性比控制。目前，人們將奶牛早期胚胎在移植前進行性別鑒定，以達到按生產需要獲得單一性別犢牛的需要的方法也納入奶牛性別控制內容。
    奶牛只有母牛產奶，一般情況下，非超群公、母牛所生的公犢生產價值極低。無論采用何種技術方法使奶牛多產母牛、少產公牛一直是人們長期努力的目標。一些方法雖然幾經努力，但收效甚微。下面僅介紹兩種奶牛性別控制的方法，不久將對奶牛的性別控制發揮明顯作用。
     (一）、X和Y精子的分離
目前，X和Y精子的分離的準確而有效的方法是流式細胞器分離。其理論根據是X精子是DNA的含量比Y精子高3-4%。具體的方法是：用特異的染料對精子進行染色，隨后將精子連同少量稀釋液逐一通過流式細胞器的激光束，其探測器可感知精子染色后的發光強度并將這一信息傳遞給計算機，經分辨后計算機令液晶充電器使發光較強的精子分離，進入兩個不同的收集容器。這樣，正電荷收集器容器得到的是X精子，負電荷收集器容器則為Y精子。用分離后的精子進行人工受精、體外受精或是顯微受精就可以得到單一性別率高的胚胎或犢牛。國外此法已開始用于商業化的運作，分離的準確率達90%以上。每小時可得到一個輸精劑量的分離精子。存在的主要問題是：流式細胞器的造價很高，投入大；分離的速度雖有較大提高，但也有下降趨勢。隨著這一技術的不斷改進和提高，這一性別控制技術將給奶牛業帶來巨大效益和廣闊的應用前景。
  （二）、SRY片段PCR擴增胚胎性別鑒定法
    最近10年來發展的用公牛特異性DNA探針和PCR（聚合酶鏈式反應）擴增技術對奶牛早期胚胎進行性別鑒定的一種準確有效的方法。其主要操作步驟是：從被測胚胎取部分卵裂球用以提取DNA，再用SRY基因的片段作引物，以所取的胚胎細胞DNA為模板進行PCR擴增，最后用SRY特異探針對擴增的產物進行檢測。雄性胚胎顯示呈陽性，雌性胚胎為陰性。也可對擴增產物進行電泳，根據SRY條帶的有無判斷胚胎為雄、雌。隨著這項技術的深入研究和進展，目前只需幾個卵裂球即可完成檢測的取樣，減少了對胚胎的傷害。經鑒定的胚胎，移植后產犢性別的準確率可達95%以上。
    此法整個操作只需幾十分鐘，有較好的應用前景，已開始了商業運作。存在的主要問題是需要實驗室條件和檢測人員的技術水平較高，否則會有假陽性結果出現，影響準確率；其次，檢測試劑盒成本較高，無疑會增加被檢測胚胎的成本。

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