華東理工大學微生物學筆記 |
第一章緒論 |
第一節微生物學的研究對象與任務 |
| 研究對象--微生物：微生物（Microorganism,,microbe）是一切肉眼看不見或看不清的微小生物的總稱。 微生物在生物界的地位：包括屬于原核生物的細菌、放線菌、藍細菌、； 屬于真核生物的真菌（包括藻狀菌綱、擔子菌綱、子囊菌綱、半知菌綱）； 以及屬于非細胞結構的病毒。微生物學的任務：利用有利的一面為人類造福、變有害為有利。 微生物與人類的關系：疾病、物質的霉變、工農業生產、生態。 |
第二節微生物學的發展 |
第一階段--推測期； |
第三節我國微生物學的發展 |
| 古代對微生物學的認識與利用：釀酒，輪作，種痘。微生物學簡況：見課本7－8 頁。 |
第二章微生物形態與結構 |
Ⅰ原核微生物 |
第一節細菌細菌的形態和大小 |
| 形態：球狀、桿狀、螺旋狀； 大小：以微米為度量單位。 細菌－原生質膜（plasma membrance）、原生質體（protoplast）、原生質。 細菌細胞的一般結構細胞壁（cell wall） 在細胞最外層、多孔性的、具有一定屏障作用，水和某些化學物質可以通過， 但對大分子物質有阻攔作用。功能：韌性、彈性。 化學組成：肽聚糖。1 G+菌G-菌核糖體(ribosome) |
華東理工大學《微生物學教程》上課講義： |
| G+菌與G -菌的細胞壁結構 內壁層(2-3nm 肽聚糖層) 外壁層(8-10nm 脂多糖層) 細胞壁為一層（20~80nm 厚的肽聚糖層） 脂多糖：O-側鏈(具有抗原性)———核心———脂質(內毒素的毒性中心) G+菌與G -菌的細胞壁組成與結構比較菌性質G+菌G－ 肽聚糖含量少(10%) 多(40~90%) 直接連接通過五肽連接鏈連接方式氨基酸組成D-Glu-NH2 D-Glu DAP L-Lys 有無脂多糖有無脂蛋白無有垣酸細胞壁與革蘭氏染色原生質體和球形體原生質體(protoplast)：指在人為條件下，用溶菌酶除盡原有細胞壁或用青霉素抑制新生細胞壁的合成后，所留下的僅有一層細胞膜包裹著的圓球狀滲透敏感細胞，一般由革蘭氏陽性菌形成。脆弱，高滲溶液球形體：指還殘留了部分細胞壁的原生質體，一般由革蘭氏陰性菌所形成。細胞膜(cell membrane) 緊貼在細胞壁內側的一層由磷脂和蛋白質組成的柔軟、富有彈性的半透性薄膜。功能：主要為控制營養物質及代謝產物進出細胞。組成：磷脂蛋白質。結構：流動鑲嵌模型。間體(mesosome) 擬線粒體細胞質(cytoplasm) 被細胞膜包圍著的除核質體外的一切透明、膠狀、顆粒狀物質，可總稱為細胞質。主要成分：核糖體、貯藏物、各種酶類、中間代謝物、無饑鹽、載色體和質粒等，少數細菌還存在羧化體、伴孢晶體或氣泡等構造。65%為核糖核酸，35%為蛋白質。是蛋白質合成的場所。原核生物70S，真核生物80S。2 貯藏物(reserve materials) |
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| 一類有不同化學成分累積而成的不溶性顆粒。在營養過剩時，聚合成各種貯藏顆粒，在營養缺乏時又被分解利用。氣泡(gas vacuoles) 存在于許多光能營養型、無鞭毛運動水生細菌中的泡囊狀內含物，內中充滿氣體。外由僅2nm 厚的蛋白質膜所包圍，具有調節細胞比重，以使其漂浮在合適水層中的作用，借以獲取光能、氧和營養物質。核質體(nuclear body) 又稱擬核，指原核生物所持有的無核膜包裹、無固定形態的原是細胞核，是遺傳的物質基礎。質粒(plasemid) 核外基因(細胞質基因)。質粒的特性：1.環狀雙鏈小分子片段；2.決定細菌的某些遺傳特性；3.獨立自我復制，可轉移，能攜帶一定的遺傳信息；4.可自行消失。細菌細胞的特殊結構莢膜(capsule) 某些細菌細胞壁外存在的一層厚度不定的膠狀物質。包括微莢膜(<200nm)；莢膜(200nm)；粘液層(無明顯界面)；菌膠團(幾個菌共有的)。莢膜的主要成分：多糖。莢膜的功能：1.保護細菌（致病菌）免受白細胞的吞噬；2.菌體外的貯存物。有莢膜的菌大多為致病菌；有莢膜菌落為光滑型致病；無莢膜菌落為粗糙型不致病。通過負染色法可觀察到鞭毛(flegellum)和菌毛(pilus , fimbria) 鞭毛：長在細菌的體表，著生在細胞膜上的長絲狀、曲波的附屬物。功能：為細菌的運動器官，運動的支點在細胞壁上。成分：為蛋白質。結構：鞭毛絲，鞭毛鉤，基體。觀察：顯微鏡，半固體穿刺。分類：單端鞭毛菌、端生叢毛菌、兩端鞭毛菌、周毛菌。鞭毛的位置和數目具有細菌分類鑒定的意義。菌毛：性菌毛，普通菌毛。3 芽孢(endospore spore) 伴孢晶體(parasporal crystal；spore-companioned crystal) |
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| 產芽孢的菌有兩類：好氣：Bacillus（枯草芽孢桿菌屬）；厭氣：Clostridium(梭狀芽孢桿菌屬)。定義：某些細菌在其生長發育后期，可在細胞內形成的一個圓形或橢圓形、厚臂、含水量低、抗逆性強的休眠構造。芽孢形成過程①束狀染色質形成；②細胞膜內陷，細胞發生不對稱分裂，其中小體積部分即為前芽孢(forespore)；③前芽孢的雙層隔壁形成，這時抗輻射性提高；④在上述兩層隔壁間充填芽孢肽聚糖后，合成DPA，累積鈣離子，開始形成皮層，折光率增高；⑤芽孢衣合成結束；⑥皮層合成完成，芽孢成熟，抗熱性出現；⑦芽孢囊裂解，芽孢游離。特性：含水量低，耐熱，含DPA-Ca。幾種位置和形狀： 如何觀察： 在形成芽孢的同時，在芽孢旁形成的一顆菱形、方形或不規則形的堿溶性蛋白質晶體。為有毒蛋白質，一般一個細菌產生一個，作為生物農藥。例：蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis） 細菌的群體形態菌落(colony)：將單個細菌（或其他微生物）或一小堆同種細胞接種在固體培養基的表面(有時為內層)，當它占有一定的發展空間并給予適宜的培養條件時，該細胞就會迅速生長繁殖并形成細胞堆，此即菌落。菌落就是在固體培養基上（內）以母細胞為中心的一堆肉眼可見的、有一定形態、構造等特征的子細胞集團。菌落特征：一般呈現濕潤、較光滑、較透明、較粘稠、易挑取、質地均勻、以及菌落正反面或邊緣與中央部位的顏色一致等。單菌落表面特征群體效應細菌的繁殖無性繁殖：不經過兩性細胞的結合，只是營養細胞的分裂或營養菌絲分化而形成同種新個體的過程。裂殖（橫分裂法）：同型，異型。繁殖的過程：細胞核和細胞質的分裂；橫隔壁的形成；子細胞的分離。 |
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| 立克次氏體(Rickettsia) 處于細菌和病毒之間，但更接近細菌。G－菌特點：具有細胞壁，不能通過細菌濾器；專性細胞內寄生，不能在人工培養基上培養。支原體(Mycoplasma) 介于細菌和立克次氏體之間，是原核生物中最小的，具有致病性。50-60 年代稱為PPLO 特點：無細胞壁，可通過細菌濾器；能在人工培養基但條件苛刻(需補充血清)；菌落形態似荷包蛋。衣原體(Chlamydia) 介于立克次氏體和病毒之間。以前將衣原體歸于病毒，沙眼衣原體特點：具有細胞壁，但能通過細菌濾器，專性細胞內寄生（能量寄生）。支原體、立克次氏體、衣原體和病毒的比較比較項目細胞構造含核酸類型DNA和RNA DNA 和RNA DNA 和RNA DNA 和RNA 核糖體細胞壁細胞膜繁殖時個體完整性大分子合成能力產ATP 系統氧化谷氨酰胺能力對抑制細菌抗生素的反應病毒衣原體立克次氏體支原體無有有有無有有有有（含肽聚糖） 有(不含肽聚糖) 無無有（無甾醇） 有（含甾醇） 無有（無甾醇） 不保持保持保持保持無無有有無無有有無無有有敏感(對抑制細胞有抗性敏感壁合成者例外) 敏感（青霉素例外） |
第三章微生物的形態與構造 |
Ⅱ真核微生物 |
| 原核生物與真核生物的比較原核生物即廣義的細菌，指一大類細胞核無核膜包裹，只存在稱作核區（nuclear region）的裸露DNA 的原始單細胞生物，包括真細菌（eubacteria）和古生菌（archaea）兩大類群。其中除少數屬古生菌外，多數的原核生物都是真細菌。真核生物是一大類細胞核具有核膜，能進行有絲分裂，細胞質中存在線粒體或同時存在葉綠體等多種細胞器的生物。真菌、顯微藻類和原生動物等是屬于真核生物類的微生物，故稱為真核微生物（eukaryotic micro-organisms）。第一節酵母菌(yeast) 存在的地方：含糖量較高的偏酸性環境（如果園）， 利用烴類的酵母菌可在油田或煤油廠附近分離到。用途：理論研究；工業生產：食品工業(饅頭發酵釀酒)， 制藥業（提取核苷酸），作為菌體蛋白；有害的酵母菌：白色念珠菌（口腔潰瘍），表皮癬菌屬（足癬） 細胞的形態構造：形態：卵圓形，假絲狀。大小：比細菌大約十倍 |
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| 構造： 細胞壁： 葡聚糖(glucan)， 甘露聚糖(mannan)；細胞膜：甾醇；細胞核：真核(如涂片好能看到的黑點即為細胞核)。繁殖方式： 無性繁殖：芽殖（主要方式），芽裂(產生橫隔壁， 較少見)，裂殖（二分分裂）。有性繁殖：形成子囊孢子進行有性繁殖，過程： 質配→ 核配→減數分裂(核配形成的雙倍體可單獨存在，因為雙倍體的酵母菌生活力強，所以工業生產上的酵母菌一般為二倍體。) 減數分裂包括二次細胞分裂和一次核分裂。在減數分裂過程中可發生基因重組。菌落特征：易挑起，乳白色，濕潤，粘稠，比細菌的菌落大而且厚，酒香味。第二節絲狀真菌——霉菌(mold) 營養來源：主要為糖類和少量氮、礦物鹽類，極易在含糖的食品（餅干、面堡、各種谷物和水果）上生長。用途：工業上；理論研究。有害的霉菌：食品的霉變等。霉菌的形態結構：與放線菌一樣為絲狀菌，但菌絲比放線菌粗約10 倍。有單細胞和多細胞之分。菌絲也有三種：基內菌絲，氣生菌絲，孢子絲。細胞壁成分：幾丁質（為多糖，由N－乙酰葡糖胺通過β-1,4 糖苷鍵相連而成）。細胞膜：甾醇。霉菌的特征性菌絲： 根霉（假根） 毛霉（） 青霉（青霉穗）曲霉（足細胞） 菌落特征：不易挑起，菌落疏松，產色素。繁殖方式：無性繁殖：通過無性孢子繁殖； 有性繁殖：也是三個階段。第四章微生物的形態和構造Ⅲ非細胞型生物第一節病毒(virion) 病毒的特性：個體極小，只能在電子顯微鏡下觀察到，能通過細菌過濾器；專性活細胞內寄生；無細胞結構。病毒是超顯微的、無細胞結構的、專性活細胞內寄生的實體。病毒的兩重性：活細胞外具一般化學大分子特征，活細胞內具生命特征。 |
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| 病毒的形態構造和化學組成病毒的大小：以納米為單位。病毒的形態：動物病毒：圓形（球形）；植物病毒： 桿形；微生物病毒(噬菌體)：蝌蚪形。病毒的化學組成：蛋白質（外殼），DNA 或RNA。病毒的結構： 衣殼粒(capsomere) →衣殼(capsid) (蛋白質外殼)； 衣殼＋核髓(core) (DNA 或RNA)→核衣殼蛋白質外殼的作用：構成病毒粒子外殼，起保護病毒核酸的作用。核髓的作用：貯存病毒的遺傳信息，控制病毒的遺傳變異、增殖及對宿主的感染性。動物病毒：線狀雙鏈DNA 或單鏈RNA；植物病毒：線狀RNA；噬菌體：線狀雙鏈DNA。病毒的群體形態包涵體(inclusion body)：某些病毒寄生在宿主中會產生在光學顯微鏡下可見的小體，是病毒或尚未裝配的病毒亞基的聚集體，屬蛋白質性質，是有毒蛋白，作為生物農藥。優點：專一性高；毒性強；使用方便；對人、畜安全；保護環境。噬菌斑(plaque)：在菌苔上逐步形成的噬菌體群體，由于其侵蝕宿主細胞的結果，會使菌苔上出現—個個具有一定形狀、大小、邊緣和透明度的噬菌斑。(nucleocapsid) 第二節病毒的繁殖噬菌體(bacteriophage)的繁殖吸附(adsorption)：吸附是特異性的，即在受體細胞上有吸附位點，這樣的吸附不僅宿主細胞表面和噬菌體之間形成牢固的化學結合，而且病毒粒子本身在結構上也發生了變化。當宿主細胞發生突變后，就不能被噬菌體吸附. 抗噬菌體菌株。宿主細胞：有吸附點；有調節機制：可以修復細胞壁的微小損傷；修復能力是有限的：一旦被噬菌體大量吸附，細胞就裂解而噬菌體沒有增殖（自外裂解） 侵入（pentration） 尾部的酶水解肽聚糖，使細胞壁產生一小孔，注入核酸，而蛋白質外殼則留在細胞的外面。尾鞘可以明顯提高噬菌體核酸的注入速率增殖（replication） 核酸的復制；蛋白質的生物合成；噬菌體DNA 一旦進入細胞中，細胞的活動受噬菌體DNA 的支配，細胞核自動裂解成碎片，根據噬菌體的基因復制噬菌體的核酸、蛋白質等外殼成熟（maturity）或裝配裂解(lysis)或釋放(release) 在固體培養基表面可見噬菌斑；在液體培養基中可見培養物被溶解，培養基變清。8 溶原性細菌（lysogen; lysogenic bacteria） |
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| 噬菌斑及噬菌體效價（titre）：在這里，效價表示每毫升試樣中所含有的具侵染性的噬菌體粒子數，又稱為噬菌斑形成單位數。一步生長曲線(one-step growth curve) 潛伏期(latent phase)，裂解期(rise phase)，平穩期(burst size)。當溫和噬菌體侵入宿主細菌細胞后，噬菌體DNA 復制，但不合成蛋白質，宿主細胞也不裂解，繼續進行正常的分裂繁殖，即在核染色體上整合有前噬菌體并正常生長。在偶爾情況下，某一代發生裂解時放出新的子代噬菌體，故具有潛在釋放成熟時菌體的能力。溶原性細菌的特征：穩定遺傳，自發裂解，誘發裂解，免疫性。溶原性細菌的復愈：溶源轉變。溶原性（lysogeny） 烈性噬菌體（lytic phage）； 溫和噬菌體（temperate phage）。噬菌體DNA 侵入宿主細胞后，噬菌體DNA 隨宿主細胞DNA 復制，噬菌體蛋白質不能合成，宿主細胞也不裂解，繼續進行正常的分裂繁殖。原（前）噬菌體（prophage）： 第二節亞病毒（subvirus） 類病毒(viroid) 1971 年首次報道；現已鑒定的有20 多種。分子結構：含246~375 個核苷酸的單鏈環狀RNA 分子，沒有蛋白質外殼。專性活細胞內寄生。例：馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTV)；鱷梨白斑類病毒。衛星RNA（satellite RNA） 依賴輔助病毒(helper virus) 進行復制的小分子單鏈RNA 片段（擬病毒） 特性：必須依賴輔助病毒才能進行侵染和復制，可干擾輔助病毒的復制。衛星病毒：必須依賴輔助病毒才能復制。9 例：衛星煙草花葉病毒STMV(Satellite tobacco moscire virus)。 |
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| 丁型肝炎病毒（Hepatitis delta virus,HDV）δ肝炎病毒；輔助病毒：乙型肝炎病毒。朊病毒（prion） 是蛋白質侵染因子(protein infection)；為疏水蛋白質。1982 年美國斯坦利.普魯西內爾(S.B. Prusiner)提出；于1997 年獲諾貝爾生理學與醫學獎。朊病毒病：庫魯病（Kuru）；克－雅氏病（CJD，Creutzfeldt-Jakob disease）；GSS 綜合癥( Gerstmann-Straussler-Scheinker)；致死性家族失眠癥（FFI，fatal familial insomnia）。潛伏期長人的朊病毒病三種形式：傳染型，遺傳型，散發型。第三節病毒與實踐噬菌體與發酵工業噬菌體的分離培養：分離；純化；制備；噬菌斑及效價測定。噬菌體的防治： 污染的原因：生產菌株本身；環境及發酵罐本身；空氣過濾器；環境；操作人員。防治：識別：正確的判斷，普及知識；消滅污染源：罐及管道的死角，控制活菌體的排放（搖瓶，排氣），凈化環境，篩選抗噬菌體菌株。病毒與人類的疾病干擾素1957 年發現，為糖蛋白，由大多數脊椎動物對病毒感染應答產生， 天然的抗病毒物質。干擾素誘導劑作用于活細胞后，由活細胞產生的一種蛋白質，當它再作用于其它細胞時，該細胞即可獲得抗病毒和抗腫瘤等方面的免疫力干擾素的作用機制蛋白質和病毒核酸結合. 抑制病毒的反轉錄干擾素的種類α- 干擾素：白細胞干擾素β- 干擾素：成纖維細胞干擾素γ- 干擾素：免疫干擾素（是由淋巴細胞接受抗原刺激而產生的）。天然產生的很少, 一般是由基因工程菌產生的人類的病毒病一般的病毒病：天花；小兒麻痹癥(脊髓灰質疫苗)；肝炎(乙肝疫苗、甲肝疫苗)；腦膜炎。理想的藥物不多,一般注射疫苗加以預防。腫瘤：1911 年，病毒可以使雞致癌。現在認為人體存在癌基因，癌基因有防癌的作用，但當它發生細胞突變時，其結構發生變化， 失去抑制細胞生長的能力，從而導致癌變。艾滋病（Aids）：全稱為人類獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune Dificiency Syndrome)， 由人體免疫缺損病毒（HIV）引起。1987 年定名。 |
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| HIV 病毒為球形。有兩種：HIV-1 危害人體（9 型，A B C D E F G H O）。致病原理： 正常的免疫系統：抗原傳遞給T 細胞.B 細胞.產生抗體。HIV 病毒與T 細胞相似，從而破壞了正常的免疫系統，由于沒有了抗體，故表現出抵抗力差。原先寄生于中非猴類上的小小病毒1981 年首先在中美洲發現1983 年從病原體上分離到了該病毒1987 年定名為HIV 治療：疫苗：滅活疫苗，重組疫苗。藥物：AZT(疊氮脫氧胸腺嘧啶核苷)。傳播途徑：不正常性行為，血液，注射器，母嬰傳給幼兒。防止策略：抑制病毒HIV 的增殖，增強機體的免疫力，杜絕傳播途徑。病毒在基因工程中的應用只有一半左右的基因參與其生命活動，因此可插入分子量較大的DNA 片段。λ噬菌體：科斯質粒（cosmid）: λ噬菌體的粘性末端和質粒構建而成。特點：感染力強；cos 位點連接形成環狀，似質粒；可克隆大片段。用途：理論研究；包涵體：昆蟲病毒的多角體用于生物防治；吞噬綠膿桿菌。危害：工業發酵的污染；人類的疾病。光能碳源\能源光能異養型有機物光能自養型無機物第五章微生物的營養和培養基營養(nutrition)：生物體從外部環境中攝取對其生命活動必須的能量和物質，以滿足正常生長和繁殖需要的一種最基本的生理功能。營養物(nutrient)：具有營養功能的物質。第一節微生物的六種營養要素細胞的化學組成：元素：C、H、O、N、礦物元素；存在形式：有機物、無機物。微生物是雜食性的：一般生物能利用的，微生物能利用；一般生物不能利用的，微生物也能利用；一般生物有害的，微生物還能利用。微生物的營養要素：碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽、水。碳源(carbon source)：有機碳源：淀粉、葡萄糖等；無機碳源：Na2CO3 等。葡萄糖、乳糖的二次生長。氮源(nitrogen source)：有機氮源：蛋白胨、黃豆粉、玉米漿；無機氮源：NH4NO3、(NH4)2SO4； 速效氮源，遲效氮源。能源(energy source)：化學物質，輻射能。生長因子(growth factor)：有三類：氨基酸，維生素，核苷酸。無機鹽：提供礦物元素和微量元素。水：水是良好的溶劑；生化反應在水中進行；水的比熱大。第二節微生物的營養類型劃分依據：碳源和能源。化學能化能異養型化能自養型 |
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| 單純擴散(simple diffusion) 氧、二氧化碳、乙醇、某些氨基酸等小分子； 親脂性分子從高濃度到低濃度的擴散來運輸它利用細胞膜的通透性，細胞膜是一道屏障。又稱被動運輸(passive transport) 促進擴散(facilitated diffusion) 需要特異性載體蛋白(carrier protein)，即滲透酶（大多為誘導酶）。每種載體蛋白運輸相應的物質。從高濃度到低濃度。原理：利用膜內、膜外被運輸物質和載體蛋白的親和力的不同。 第三節營養物質進入細胞的方式營養物質的吸收與代謝產物的分泌，涉及到物質的運輸，而關鍵是細胞膜。運輸：不耗能運輸（單純擴散，促進擴散）；耗能運輸（主動運送，基因移位）。主動運送(active transport) 是微生物吸收營養的主要方式。需要特異性載體蛋白需要能量來改變載體蛋白的構象。是逆濃度梯度的運輸。基團移位(group translocation) 在運輸過程中，物質分子發生了化學變化。每輸入一個葡萄糖分子，就要消耗一個ATP 的能量。 |
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| 第四節培養基培養基(medium，culture medium)：是一種人工配制的、適合微生物生長繁殖或產生代謝產物用的混合養料。選用和設計培養基的原則和方法四個原則：目的明確（根據不同微生物的營養需要配制不同的培養基）；營養協調（注意營養物的濃度和配比，特別是碳氮比（ C/N ））；物理化學條件適宜（PH、滲透壓、水活度）； 經濟節約。四種方法：生態模擬，查閱文獻，精心設計，試驗比較。培養基的種類及其應用按對培養基的了解來分天然培養基(complex medium, undefined medium)，較經濟，一般用于大規模生產組合培養基(defined medium)或稱合成培養基(synthetic medium)，較昂貴，一般用于研究工作（代謝、遺傳分析），特點：組份精確，重復性好。按培養基外觀的物理狀態來分固體培養基(solid medium)，一般加有凝固劑，凝固劑含量一般為1～2％ 作為凝固劑的條件：不被微生物分解利用，生長溫度范圍內保持固體狀態，凝固點溫度對微生物無害，不因滅菌而破壞，透明度好、配制方便、價格低。用途：由于固體培養基能提供表面，形成單菌落，因此可用于：菌種分離、鑒定、保藏等半固體培養基(semi-solid medium)，凝固劑含量一般約為0.5% 用途：觀察細菌的運動，測定噬菌體效價等。液體培養基(liquid medium)，培養基中沒有凝固劑。用途：大量培養微生物，研究生理代謝等。按培養基的功能來分選擇培養基(selected medium) 用途：將混合軍中所需的目的微生物分離出來加富培養基(enriched medium) 鑒別培養基(differential medium) 用途：細菌學檢驗遺傳研究第六章微生物的代謝和發酵新陳代謝(metabolism)簡稱代謝，是指發生在活細胞中的各種分解代謝(catabolism)和合成代謝(anabolism)的總和。即新陳代謝＝分解代謝＋臺成代謝分解代謝又稱異化作用，是指復雜的有機物分子通過分解代謝酶系的催化產生簡單分子、能量(一般以腺苷三磷酸即ATP 形式存在)和還原力(或稱還原當量，一般用[H]來表示)的作用。合成代謝又稱同化作用，與分解代謝正好相反，是指在合成代謝酶系的催化下，由簡單小分子、ATP 形式的能13 初級代謝： 次級代謝： 第一節微生物的能量代謝華東理工大學《微生物學教程》上課講義量和[H]形式的還原力一起，共同合成復雜的生物大分子的過程。最初的能源（primary energy sources）： 有機物，還原態無機物，日光輻射能。通用能源（universal energy source）： ATP。生物氧化：脫氫、遞氫、受氫。發酵：基質為有機物，最終電子受體為有機物。葡萄糖→ 丙酮酸（EMP 途徑） 產生2 個ATP（ 底物水平磷酸化） 由于基質氧化不徹底，發酵的結果仍積累有機物，所以產生的能量較少。例：葡萄糖→ 丙酮酸→乳酸，產生54 kcal 的能量不同的微生物發酵可產生不同的產物，例：葡萄糖→ 丙酮酸→乳酸or 乙醇or 丙酮丁醇有氧呼吸：徹底的氧化過程。基質為有機物，最終電子受體為分子氧。葡萄糖→CO 產生38 個ATP，其中底物水平磷酸化產生2 個ATP，氧化磷酸化產生36 個ATP EMP 途逕：葡萄糖→丙酮酸；丙酮酸→乙酰CoA（氧化脫羧體系）；TCA 循環。電子傳遞鏈無氧呼吸： 基質為有機物，最終電子受體為無機物。C6H12O6+12KNO3→6CO2+12KNO2+6H2O ＋ 429kcal 三種生物氧化方式的產能水平比較2 + H2O |
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| 最高：有氧呼吸，第二：無氧呼吸， 最低：發酵。“鬼火”的生物學解釋： 在無氧條件下，某些微生物在沒有氧、氮或硫作為呼吸作用的最終電子受體時，可以磷酸鹽代替，其結果是生成磷化氫(PH３)，一種易燃氣體。當有機物腐敗變質時，經常會發生這種情況。若埋葬尸體的墳墓封口不嚴時．這種氣體就很易逸出。農村的墓地通常位于山坡上，埋葬著大量尸體。在夜晚， 氣體燃燒會發出綠幽幽的光，長期以來人們無法正確地解釋這種現象，將其稱之為“鬼火”。烴類化合物的分解烴類化合物主要是被氧化，是一個絕對需氧的過程，在缺氧條件下，烴類完全不受微生物影響。（所以地下沉積的石油會長期不變） 能分解烴類的微生物：細菌（假單胞菌，分枝桿菌，棒狀桿菌）；放線菌（鏈霉菌，諾卡氏菌）；酵母菌。一般在油田及煉油廠附近都能分離到。應用：萘被假單胞菌利用生成水楊酸；丙烯氰生成丙烯酰胺；石油脫蠟；石油代替糧食發酵； 石油探測。絕對好氧：優點：石油不被破壞；缺點：發酵過程需通入大量氧氣，消耗動力；發酵培養基中需要加乳化劑（因為烴類石油類物質，與水不相容）。第二節生物固氮固氮生物：能使氮分子還原成氨的生物。一般均為原核生物，于1888 年分離到。能固氮的微生物：自生固氮菌，共生固氮菌，聯合固氮菌。固氮的生化機制：固氮反應的必要條件：固氮酶(nitrogenase)，能量（ATP），還原力，嚴格的厭氧微環境。固氮的生化途徑：N2+8[H]+18~24ATP→2NH3+H2+18~24ADP+18~24Pi |
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| 第七章微生物的生長及其控制生長(growth)：個體體積或重量的變化；繁殖(reproduction)：個體數量的變化。個體生長→個體繁殖→群體生長；群體生長＝個體生長＋個體繁殖。生長和繁殖是交替進行的。衡量群體生長的量：重量、體積、密度、濃度、個體數目等。第一節測定生長繁殖的方法純培養的分離法自然界中的微生物都是雜居在一起的，每種微生物的生長情況是不同的。純種分離：稀釋到平皿法；平板劃線分離法； 單細胞挑取法；利用選擇培養基分離法。微生物生長的測定測定生長量：測體積；稱干重；比濁法；生理指標法(測含氮量；測含碳量；測磷、DNA、RNA、ATP。) 測細胞的個數：比例計數法、血球計數法、平板活菌計數法。 第二節微生物的生長規律細菌的個體生長和同步生長。研究細菌個體的生長方法：用電子顯微鏡觀察細胞的超薄切片； 同步培養(synchronous culture)：使群體中的所有個體細胞盡可能的處于同樣細胞生長和分裂期中。同步生長（synchronous growth）：通過同步培養使細胞群體處于分裂步調一致的狀態。獲得同步生長的方法：選擇法，誘導法。典型生長曲線(growth curve) 四個階段： 延滯期、指數期、穩定期、衰亡期。16 華東理工大學《微生物學教程》上課講義生長速率常數(growth rate constant)：每小時分裂的代數R。延滯期(lag phase) 特點：生長速率常數為零，代謝活躍，對外界不良環境敏感，細胞變大，RNA(特別是rRNA) 含量增高。如何縮短延滯期：種齡，接種量，培養基成分。指數期(exponential phase) 特點：生長速率常數最大，代時(generation time)最短，細胞平衡生長，酶系活躍，代謝旺盛。作為發酵生產的良好種子，可縮短延滯期。穩定期(stationary phase) 特點：生長速率常數為零，菌體產量達最高點，菌體產量與營養物消耗有一定的比例關系。穩定期到來的原因：營養物耗盡，營養物比例失調，積累了有害代謝產物，理化條件不適宜。如何延長穩定期：補料（增加養料，調節PH）。細胞開始貯存糖原、異染顆粒和脂肪等貯藏物，芽孢桿菌開始形成芽孢，積累次級代謝產物。初生代謝物(primary metabolites)，次生代謝物(secondary metabolites)，穩定期產物(idiolites)，菌體生長期(trophophase)，代謝產物合成期(idiophase)。衰亡期(decline phase；death phase) 特點：負生長，菌體自溶。如何利用生長曲線指導生產？種齡：利用對數生長期的種子；延長穩定期；確定放罐時間。微生物的連續培養：單（分）批培養(batch culture)， 密閉培養(closed culture)，連續培養(continuous culture)，開放培養(open culture)。恒濁器（turbidostat） 改變培養基的流速，以控制菌的濃度恒定。微生物在恒濁器中始終以最高的生長速率進行生長。用于獲得大量菌體、與菌體生長相平行的代謝產物的生產。恒化器（chemostat；bactogen） 培養基的流速恒定，以某一營養物為生長限制因子。用于與生長速率相關的理論研究。單級連續培養器(one-step continuous fermentor)： 代謝產物的生產速率與菌體生長速率平行。多級連續培養器(multi-step continuous fermentor)： 代謝產物的生產速率與菌體生長速率不平行。連續發酵（continuous fermentation） 連續培養用于生產實踐時，就稱為連續發酵連續培養的優缺點優點：高效，便于自動控制，產品質量穩定。缺點：菌種易退化，易污染雜菌，培養基利用率低。高密度培養（high cell-density culture） 基因工程菌提高產物的比生長率：單位時間單位體積內的產物量。提高分離提取的效率（下游工程down-stream processing）。關鍵問題：補料，提高溶解氧濃度。 17 第三節影響微生物生長的主要因素溫度從兩個方面來看： 溫度上升，反應速率加快，生長速率加快；溫度上升，蛋白質、核酸被破壞。微生物的生長有一個溫度范圍，在這個范圍內有一個生長的最適溫度、最低溫度和最高溫度。最適溫度：菌代時最短，生長速率最高。氧氣專性好氧菌(strict aerobe) ， 兼性厭氧菌(facultative aerobe) ， 微好氧菌(microaerophilic bacteria)，耐氧菌(aerotolerant anaerobe)，厭氧菌(anacerobe)。好氧生物因為有SOD，因此劇毒的超氧陰離子自由基（O2·－ ） 被歧化成毒性稍低的H2O2 ， 在過氧化氫酶的作用下，H2O2 再變成無毒的H2O。PH 最適PH，最低PH，最高PH。PH 的影響：影響營養物的離子化程度，影響環境中有毒物質對微生物的粗性，影響代謝反應中各種酶的活性。 華東理工大學《微生物學教程》上課講義物理殺菌因素的代表——溫度利用高溫殺菌：干熱滅菌（焚燒滅菌，灼燒滅菌）；濕熱滅菌（煮沸消毒法，高壓蒸汽滅菌法，間歇滅菌法，巴斯德消毒法） 化學殺菌劑或抑菌劑表面消毒劑（重金屬鹽類：紅汞； 有機化合物：酚類、醇類、酸類、醛類；氧化劑：鹵素及其化合物； 表面活性劑：新潔爾滅，肥皂；染料：龍膽紫；氣體：環氧乙烷）。抗代謝藥物的代表——磺胺類藥物第四節有害微生物的控制滅菌(sterilization)：采用強烈的理化因素使任何物體內外部的一切微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施，稱為滅菌。消毒(disinfection)：采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內部一部分對人體或動植物有害的病原菌，而對被消毒的對象基本無害的措施。防腐(antisepsis)：利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，即通過制菌作用（becteriostasis）防止食品、生物制品等對象發生霉腐的措施。化療(chemotherapy)：利用具有高度選擇毒力（selective toxicity）即對病原菌具高度選擇毒力而對其宿主基本無毒的化學物質來抑制宿主體內病原微生物的生長繁殖，借以達到治療該宿主傳染病的一種措施。抗代謝藥物一類在化學結構上與細胞內必要代謝物的結構相似，并可干擾其正常代謝活動的化學物質。SMZ：磺胺二甲惡唑（sulfamethoxazole） |
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| 抗生素抑制細胞壁的形成－青霉素（青霉素不能口服，它不耐酸，在胃中被降解）； 影響細胞膜的功能－多粘菌素； 干擾蛋白質合成－鏈霉素； 阻礙核酸的合成－博萊霉素。微生物的抗藥性。微生物對環境的適應性產生鈍化酶；改變細胞膜的透性；細胞內被藥物作用的部位發生改變。利用抗藥性來指導生產例：如何利用抗磺胺類藥物的菌株生產對氨基苯甲酸？ 磺胺對氨基苯甲酸如果對氨基苯甲酸增加，磺胺藥療效降低，所以尋找抗磺胺藥的菌株就可增加對氨基苯甲酸的產量。第八章微生物的遺傳變異和育種遺傳性：親代具有把他所有的形狀給子代的特性。變異性：子代具有改變親代遺傳性狀的特征。遺傳型（genotype），表型（phenotype），變異（varition），飾變（modification）。 第一節遺傳變異的物質基礎三個經典實驗： 轉化試驗：1928 年，F. Griffith，肺炎雙球菌， Streptococcus pneumoniae。1944 年,O.T.Avery DNA RNA 蛋白質多糖DNA+DNA 酶RⅡ RⅡ RⅡ RⅡ RⅡ 少量SⅢ - - - ___ 噬菌體感染試驗:1952 年,A. D. Hershey（侯喜） M. Chase（蔡斯） 病毒的重建試驗: 1956 年，H. Fraenkel-Conrat （弗朗克－康勒脫） 噬菌體感染試驗和病毒的重建試驗的說明圖見下頁 |
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| 朊病毒的發現和思考：蛋白質是否是遺傳的物質基礎？prpsc，蛋白質折疊。DNA 的結構基本單位是核苷酸：核糖(戊糖)＋堿基＋磷酸。堿基有四種：腺嘌呤（A），鳥嘌呤（G），胸腺嘧啶（T）， 胞嘧啶（C）。單鏈上的堿基不受配對的限制，決定了遺傳的多樣性。半保留的自我復制保證了生物遺傳的相對穩定。第二節基因突變和誘變育種20 基因突變（gene mutation）：突變細胞的遺傳物質的分子結構或數量發生可遺傳的變化。突變的類型： 營養缺陷型（auxotroph）菌株:野生型菌株發生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子的能力,從而不能在基本培養基上生長的變異菌株。抗性突變型（resistant mutant）菌株:野生型菌株發生基因突變而對某化學藥物或致死物理因子產生抗性的菌株。 |
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| 條件致死突變型（conditional lethal mutant）菌株:菌株發生基因突變后,在某種條件下可正常生長，而在另一種條件下無法生長。形態突變型（morphological mutant）菌株:菌株發生基因突變，而在個體形態或菌落形態上發生突變的菌株。抗原突變型（antigenic mutant）菌株:菌株發生基因突變，而在細胞抗原結構上發生變異的菌株。產量突變型（metabolite quantitative mutant）菌株:菌株發生基因突變，在代謝產物產量上明顯有別于原始菌株的突變株。正變株（plus-mutant）；負變株（minus-mutant）。突變率（mutation rate）：一個細胞每一世代某一性狀突變的幾率；群體中每一世代（分裂一次）產生突變的個數。突變率：10－8 基因突變的特點： 不對應性：突變的性狀與引起突變的原因之間沒有直接的對應關系； 自發性（10－6～10－9）；稀有性；獨立性；可誘變性；穩定性； 可逆性：回復突變（reverse(back)mutation）。證明基因突變自發性和不對應性的實驗： 變量試驗(fluctuation test)：波動試驗、彷徨試驗；1943 年；S. E. Luria＆ M. Delbruck。涂布試驗：1949 年，H.B.Newcombe 影印平板培養法(replica plating):1952 年,J. Lederberg 微生物產生抗藥性的途徑： 基因突變而產生抗藥性； 抗藥性質粒的獲得(R 因子)； 生理上的適應。基因突變及其機制： 右圖為突變的類型。 |
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| 誘變（induced mutation）： 堿基的置換（substitution），轉換（transition），顛換（transversion）。兩個例子:亞硝酸；5-溴尿嘧啶(堿基類似物base analog)。移碼突變(frame-shift mutation phase-shift mutation) |
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| 染色體畸變(chromosomal aberration) 轉座(transposition)：DNA 序列通過非同源重組的方式，從染色體某一部位轉移到同一染色體的另一部位或其它染色體上的某一部位。轉座因子(transposable element):具有轉座作用插入序列(insertion sequence，IS)；轉座子（transposon，Tn）； 轉座噬菌體(transposable phage) 自發突變（spontaneous mutation）：由微生物自身有害代謝產物引起；由DNA 復制過程中堿基配對錯誤引起；由背景輻射和環境因素引起。遺傳密碼改變的表型效應： |
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| 紫外線對DNA 的損傷及其修復紫外線(ultraviolet ray)對DNA 的損傷；嘧啶二聚體； 光復活作用(photo reactivation，photo restoration) 切除修復（excision repair） 突變與育種自發突變與育種（ Breeding by spontaneous mutation） 從生產中育種；定向培育優良菌株。自然選育的目的：維持原有的產物的合成水平(穩產)；誘變后的菌株群體中表現出各種生理特性需要純化。誘變育種（breeding by induced mutation） 誘變育種的幾個方向：提高產量；改進產品質量；產生新的生物活性物質誘變育種的基本環節（左圖所示） 出發菌株→誘變→初篩→復篩→放大→獲得優良變異株。誘變育種兩個主要的環節：誘變（induced mutation）；篩選（screening）。誘變育種中的幾個原則： 誘變劑的選擇：簡便有效； 誘變劑的種類：物理誘變劑，化學誘變劑，擬輻射物質（radiomemetic chemical）； 誘變劑量的選擇：存活率或死亡率曲線，劑量-誘變率曲線； 出發菌株(original strain)的選擇：處理細胞所處的狀態，一般為單孢子懸液； 表型延遲(phenotype lag)：遺傳型雖已突變,但表型卻要經染色體復制、分離和細胞的分裂后才表現出來。利用復合處理的協同效應（synergism）；利用和創造形態、生理和產量之間的相關指標；設計高效的篩選方法：推理選育。突變株的篩選:產量突變株的篩選,抗藥性突變株的篩選,營養缺陷型菌株的篩選 |
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| 營養缺陷型突變株：野生型菌株（wide type strain）；原養型（prototroph）； 回復突變株（back mutant, reverse mutant）；基本培養基（minimum medium,MM)； 補充培養基(supplemented medium，SM）；完全培養基（complete medium，CM）。前體1→A→B→C→D→前體2 途徑α β γ 酶↑ ↑ ↑ a b c 基因一個基因一條多肽鏈篩選營養缺陷型菌株的四個環節： 誘變；淘汰野生型（抗生素法，菌絲過濾法）；檢出缺陷型（夾層培養法，限量補充法，逐個檢出法，影印平板法）；鑒定缺陷型（生長譜法）。維生素的生長譜營養缺陷型菌株的應用：賴氨酸，研究代謝途徑。氨基酸的生長譜 |
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| 研究代謝途徑： 粗糙鏈孢霉（Neurospora crassa） 瓜氨酸－ ＋ ＋ 鳥氨酸－ － ＋ 突變株Ⅰ 突變株Ⅱ 突變株Ⅲ 精氨酸＋ ＋ ＋ 前體→鳥氨酸→瓜氨酸→精氨酸→.. 艾姆氏試驗(Ames test)：生物的遺傳物質是核酸；凡對微生物有效的誘變劑對高等動物同樣有效；化學藥劑對細菌的誘變率與其對動物的致癌率成正比；凡致癌物質都是誘變劑，但并非所有的誘變劑都能致癌；95％的致癌劑有誘變作用， 約90％的非致癌劑就沒有誘變劑的作用。材料：鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株，老鼠肝臟抽提液。 第三節基因重組和基因雜交基因重組(gene recombination) 遺傳重組(genetic recombination)：兩個獨立基因組內的遺傳基因，通過一定的途徑轉移到一起，形成新的穩定基因組的過程。原核生物的基因重組轉化(transformation) 轉導(transduction) 接合(conjugation, mating) 原生質體融合(protoplast fusion) 轉化：受體菌直接吸收來自供體菌的DNA 片段，通過交換把他整合到自己的基因組中，從而獲得供體菌部分遺傳性狀的現象。受體細胞（recipient cell, receptor） 供體細胞（donor cell） 轉化子（transformant） |
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| 感受態：受體細胞最易接受外源DNA 片段并實現轉化的生理狀態。轉化的過程：感受態細胞吸收DNA；DNA 摻入細胞后的整合。轉化的要求：受體細胞處于感受狀態（competence） 轉化的特點：直接吸收；受體細胞處于感受態轉染（transfection） 轉導：通過缺陷噬菌體的媒介，將供體細胞的DNA 片段攜帶入受體細胞中，通過交換和整合， 使后者獲得前者的部分遺傳性狀。缺陷噬菌體（defective phage） 轉導子（transductant） 普遍性轉導（generalized transduction）：完全缺陷噬菌體。特點：隨機包裹；轉導子非溶原性。局限性轉導（specialized transduction）：部分缺陷噬菌體。特點：轉導的是特定基因；轉導子為缺陷溶原性。普遍性轉導和局限性轉導的比較普遍性轉導和局限性轉導的比較普遍轉導任何基因能轉導的基因不結合到寄主上噬菌體在寄主中的位置獲得轉化噬菌體的方式轉導子的區別通過敏感菌的裂解非溶原性特定基因結合到寄主上通過溶源菌的誘導部分溶原性 |
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| 溶源轉變lysogenic conversion 接合：供體菌（F＋菌株，雄性菌株）通過性菌毛與受體菌（F-菌株，雌性菌株）直接接觸，把F 質粒或其攜帶的不同長度的核基因組片段傳遞給后者，使后者獲得若干新的遺傳性狀。F+菌株；F-菌株；Hfr 菌株；F’菌株。特點：兩細胞直接接觸；需要性因子性因子可通過接合獲得。原生質體融合：通過人工的方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體進行融合，從而獲得兼有兩親本遺傳性狀的重組子。原生質體技術的優越性：去掉了細胞壁的障礙，親株基因組可直接融合、交換，并為鏈霉菌實現基因轉化創造了條件；二親株的基因組之間可發生多次交換，得到多種類型的重組子， 且參與融合的親株不限于一個，可以多至3、4 個；重組頻率高；可用誘變的方法直接處理原生質體，提高突變率；再生成細胞壁的過程常伴隨治理的消除，使染色體發生改變；極其簡單，操作方便，不需要貴重藥品。 |
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| 如何得到原生質體：菌體（菌絲）培養；細胞壁的去除；原生質體的融合（再生）； 檢出重組子。再生頻率的計算： 原生質體數H－原生質體數水再生頻率＝———————————— 原生質體總數（血球計數） 原生質體技術的應用：利用原生質體形成及再生達到改良親本的目的（大環內酯類抗生素）；利用原生質體誘變提高突變率（慶大霉素）；利用原生質體融合獲得性的抗生素（Indolizomycin）；利用再生，得到了產量提高的變異菌株，例如生二素鏈霉菌（Streptomytece ambofaciens）通過原生質體再生，螺旋霉素的生產能力提高了三倍多。質粒消除的結果常常導致細胞染色體的改變，或使次級代謝途徑發生變化(白霉素和金絲霉素)，出現有利于提高抗生素產量的變異菌株。有效的種間融合，使兩個產生不同抗生素菌株的調節基因和結構基因重組在一起，誘發一些原來為“沉默基因’的表達，從而產生新物質。同時種間融合還可能使兩個產生不同抗生素菌株的結構基因重組而產生雜種抗生素。真核微生物的基因重組有性雜交（sexual hybridization） 準性雜交（parasexual hybridization） 同種而不同菌株的體細胞間發生的融合，常見于半知菌類。準性雜交過程：菌絲聯結（anastomosis）；形成異核體（heterocaryon）；核融合（nuclear fusion）；體細胞交換（somatic crossing-over）和單倍化。第四節基因工程基因工程(gene engineering) 遺傳工程（genetic eng ineering）：人工的離體的分子水平上的遺傳重組技術。基本操作：獲取目的基因；優良載體的選擇； 目的基因與載體DNA 的體外重組；重組載體導入受體細胞（轉化）；重組受體細胞的篩選和鑒定；工程菌的表達。 |
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| 對質粒載體的要求：是一個獨立的復制子；具有較多的單一限制性內切酶位點；有方便的篩選標記；具有外源DNA 片段插入失活的附加標記；高拷貝數。應用： 生產多肽類藥物:干擾素(interferon)，白細胞介素（ interleukin ）； 生產疫苗：乙肝疫苗； 改造傳統工業發酵的菌種； 改良動植物的特性； 用于環境保護的“超級菌”的構建。工程菌的不穩定性。 |
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| 第五節菌種的衰退、復壯和保藏菌種的衰退和復壯衰退（degeneration）:菌種的特性發生了負變，如生長速度減慢、代謝產物合成能力下降。菌種衰退的原因：自發突變。衰退的防止：控制傳代次數；創造良好的培養條件；利用不易衰退的細胞傳代； 采用有效的菌種保藏方法。復壯：從已衰退的群體中篩選出少數沒有退化的個體。菌種的復壯：純種分離法(pure culture isolation)，包括菌落純（pure culture in colony lever）和菌株純（ pure culture in strain lever ）； 通過寄主體復壯。菌種的保藏菌種保藏的意義：菌種是一個國家極其重要和寶貴的生物資源。菌種保藏的原理：通過保持培養基營養成分在最低水平，缺氧狀態，干燥和低溫， 使菌種處于“休眠”狀態，抑制其繁殖能力。菌種保藏的方法： 斜面冰箱保藏法：斜面保藏是一種短期、過渡的保藏方法，用新鮮斜面接種后， 置最適條件下培養到菌體或孢子生長豐滿后，放在4℃冰箱保存。一般保存期為三個月到六個月沙土管保藏法：適合于產孢子或芽孢的微生物。將斜面孢子制成孢子懸浮液接入沙土管中或將斜面孢子刮下直接與沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱內保存。一般保存期為1 年左右。菌絲速凍法：對于不產孢子或芽孢的微生物，一般不能用沙土管保藏。為了方便可以采用甘油菌絲速凍法。由于該法的保藏溫度為-20℃，為了避免微生物受損傷致死，需要甘油作為保護劑。甘油的最終濃度為25%。石蠟油封存法：向培養成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過菌的石蠟油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可適用于不能利用石蠟油作碳源的細菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期約一年左右。真空冷凍干燥保藏法：目前常用的較理想的一種方法。在真空中使水分升華。微生物的生長和代謝都暫時停止，不易發生變異。菌種保存時間一般５年左右。需要一定的設備。保護劑一般采用脫脂牛奶或血清等。保護劑的作用可能是在冷凍干燥的脫水過程中代替結合水而穩定細胞成分(細胞膜)的構型，防止細胞膜因為凍結而破壞。保護劑還可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。液氮超低溫保藏法：適用范圍最廣的微生物保藏法。尤其是一些不產孢子的菌絲體，用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最長。原理：用液氮能長期保存菌種。這是因為液氮的溫度可達-196℃，遠遠低于其新陳代謝作用停止的溫度(－130℃)，所以此時菌種的代謝活動已停止，化學作用亦隨之消失。需要保護劑，常用的保護劑為10%甘油。先將菌液降溫到0℃，再以每分鐘降低1℃的速度，一直降低到-35℃，然后才把裝有菌液的安瓿管放入液氮罐的氣相中。國內菌種保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會(China Committee for Culture Collection of |
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| Microorganisms． CCCMS)委托中國科學院負責擔負全國菌種保藏管理業務，下設六個菌種保藏管理中心。l)普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC) 中國科學院微生物研究所，北京(AS)：真菌，細菌。中國科學院武漢病毒研究所，武漢(AS—IV)：病毒。2)農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC) 中國農業科學院土壤肥料研究所，北京（ISF）。3)工業微生物菌種保藏管理中心(CICC) 輕工業部食品發酵工業科學研究所，北京(IFFI)。4)醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC) 中國醫學科學院皮膚病研究所，南京(ID):真菌。衛生部藥品生物制品檢定所，北京(NICPBP)：細菌。中國醫學科學院病毒研究所，北京：病毒。5)抗生素菌種保藏管理中心(CACC) 中國醫學科學院抗生素研究所，北京(IA)。四川抗生素工業研究所，成都(STA)：新抗生素菌種。華北藥廠抗生素研究所，石家莊(IANP)：生產用抗生素菌種。6)獸醫微生物菌種保藏管理中心(CVCC) 農業部獸醫藥品監察所，北京。國外菌種保藏機構l)ATCC American Type Culture Collection． Rockvill． Maryland． U.S.A． 美國標準菌種收藏所，美國，馬里蘭洲，羅克維爾市。2) CSH Cold Spring Harbor Laboratory. U.S.A． 冷泉港研究室，美國。3) IAM Institute of Applied Microbiology. University of Tokyo， Japan． 日本東京大學應用微生物研究所，日本東京。4) IFO Institute for Fermentation. Osaka, Japan． 發酵研究所,日本大阪。5) KCC Kaken Chemical Company Ltd. Tokyo， Japan． 科研化學有限公司，日本東京。6) NCTC National Collection of Type Culture. London , United Kingdom． 國立標準菌種收藏所，英國倫敦。7) NIH National Institutes of Health. Bethesda， Maryland， U.S.A． 國立衛生研究所，美國，馬里蘭洲，貝塞斯達。第一節微生物在自然界中的分布與菌種資源的開發第九章微生物的生態生態學（ecology）:研究生命系統和和環境系統間相互作用規律的科學一些概念：生物圈(biosphere)；生態系統(ecosystem)；群落(community)；種群(population)；個體(individual)；器官(organ)；組織(tissue)；細胞(cell)； 細胞器(organelle)；分子(molecule)。微生物生態：各種環境因素對微生物的作用及微生物對外界環境的反作用。微生物在自然界的分布：海陸空。 |
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| 個體小；營養類型多；存在休眠體。土壤中的微生物：為什么土壤是微生物的天然培養基？營養豐富；PH 適宜；溫度、通氣。分布情況:細菌，放線菌，霉菌，酵母菌。水體中的微生物：水中的病原微生物大腸菌群值＝1000／大腸菌群數飲用水的標準：總細菌數：<100 個/ml；大腸菌群數：< 3 個／l。空氣中的微生物：主要附著在灰塵上。如何檢查空氣中的微生物：平板檢查法；將空氣通入水中，檢查水中的細菌；塵埃粒子計數器。空氣中微生物的處理:空氣過濾器；紫外線照射；噴霧消毒。工農業產品中的微生物：工業產品的霉腐；食品上的微生物；農產品上的微生物。極端環境下的微生物:嗜熱微生物；嗜冷微生物；嗜酸微生物；嗜堿微生物；嗜鹽微生物；嗜壓微生物；抗輻射微生物。第二節微生物與生物環境間的關系互生共生寄生拮抗捕食互生(metabiosis):兩種可單獨生活的生物，當它們在一起時，通過各自的代謝活動而有利于對方，或偏利于一方的生活方式。“可分可合，合比分好” 互生的例子:固氮菌Vs 纖維素分解菌人Vs 腸道中的正常菌群排阻、抑制外來致病菌；產生有助于消化的淀粉酶、蛋白酶；分解有毒物質；營養物質。共生（symbiosis）:兩種生物共居在一起，相互分工合作，合二為一的極其緊密的一種相互關系。“相依為命，難分難解” 共生的例子:地衣（lichen）：真菌與藻類； 根瘤菌與植物；反芻動物（牛）與瘤胃微生物。寄生（parasitism）：一種小型生物生活在另一種較大生物體內或體表，從中奪取營養進行生長繁殖，并使后者蒙受損失甚至被殺死的一種相互關系。寄生物（parasite）；寄主（host）。寄生的例子:噬菌體與宿主菌；煙草與TMV；人與病原微生物。拮抗（antagonism）:某種生物產生的特定代謝產物可抑制其他生物的生長甚至殺死它們的一種相互關系。特異性拮抗；非特異性拮抗。拮抗的例子:青霉菌產生青霉素；乳酸菌產酸。捕食(predatism, predation):一種大型生物直接捕捉、吞食另一種小型生物以滿足其營養需要的相互關系。捕食的例子:原生動物與細菌。第三節微生物與環境保護水體的污染——富營養化水體自凈：天然水體受到污染后，在無人為處理的條件下，借水體自身的能力得到凈化的過程。 |
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| 物理作用：稀釋，沉降，擴散；化學作用：氧化，還原，分解，凝聚； 生物作用：細菌。富營養化（eutrophication）:水華（water bloom），赤潮（red tide）。用微生物治理污水。污水分為生活污水和工業廢水。評價水質的指標： 化學需氧量COD(chemical oxygen demand):用強氧化劑使一升污水中所含的有機物氧化所消耗的氧的毫克數。生化需氧量BOD(biochemical oxygen demand)：微生物在有足夠溶解氧存在的條件下，分解一升污水中所含有機物過程中所消耗的水中溶解氧的毫克數BOD5:20℃，5 天，1 升水溶解氧的減少量。生物的污水處理:完全混合曝氣法；活性污泥法；生物膜法。活性污泥（activated sludge）:由或細菌、原生動物和其他微生物群聚集在一起組成的凝絮團，在污水處理中具有很強的吸附、分解有機物或有毒物的能力。細菌是分解有機物的主力；細菌聚集成菌膠團,形成絮狀物。細菌：吸附有機物,并分解之；吸附金屬離子與有機物形成絡合物；保護細菌；利于沉降； 原生動物:吞噬游離細菌；吞噬微小污泥；分泌粘性物質；利于絮凝； 霉菌:利于絮凝； 酵母菌:分解氰、酚。預處理：去掉一些大的顆粒、稀釋污水；曝氣：微生物分解有機物或有毒物；沉淀：出水、回流部分污泥。曝氣的原理：是群體的協同作用。生物膜法（biofilm）:生長在潮濕、通氣的固體表面上的一層由多種活微生物構成的粘滑、暗色菌膜， 能氧化、分解污水中的有機物或某些有毒物。第一節傳染第十章傳染與免疫傳染與傳染病。傳染（infection）:病原微生物侵入機體后，在一定的部位生長、繁殖，從而引起一系列病理生理的過程。由于機體的抵抗力和病原菌兩方面的力量不同以及環境因素的影響，有時不表現臨床癥狀，成為隱性傳染或帶菌狀態，有時表現出臨床癥狀——傳染病。傳染病（infectious disease）:可從一個宿主個體直接或間接傳播到另一宿主個體的疾病。免疫:抗傳染免疫（免疫防護）：變態反應；自身穩定功能：自身免疫疾病；免疫監視作用：腫瘤病。 |
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| 決定傳染結局的三大因素:病原體；宿主的免疫力；環境因素。病原體毒力(virulence)，致病力(pathogenicity)。侵襲力（invastiveness）:吸附和侵入能力；繁殖與擴散能力；抵抗宿主防御功能的能力。毒素（toxin） 外毒素（exotoxin）:病原菌生長過程中不斷向外界環境分泌的一類毒性蛋白。毒性強，抗原性強，毒性不穩定（對熱和化學物質敏感）；0.3－0.4%甲醛脫毒。內毒素（endotoxin）：是G-菌細胞壁外層的組分之一，化學成分為脂多糖（LPS）， 一般不分泌到環境中。毒性低，抗原性弱，化學穩定性強。熱源物質（pyrogen）。入侵病原體的數量;侵入門徑（entry point）。宿主的免疫力免疫力（immunity）：免疫防御(immunologic defence)；免疫穩定(immunologic homeostasis)；免疫監視(immunologic serveillance)。環境因素：宿主環境（先天，后天）；外界環境；自然環境；社會環境。傳染的三種可能結局：隱性傳染(inapparent infection)；帶菌狀態(carrier state)；顯性傳染(apparent infection)。 第二節非特異性免疫非特異性免疫（nonspecific immunity）；先天免疫（innate immunity）；自然免疫（natural immunity）。自然免疫：在生物長期進化過程中形成，屬于先天即有、相對穩定、無特殊針對性的對付病原體的天然抵抗力。表皮和屏障結構（barrier structure）：機械作用；化學保護作用；正常菌群的拮抗作用；粘膜表面的免疫球蛋白。皮膚與粘膜；血腦屏障(blood-brain barrier)：內皮細胞層,細胞間連接緊密, 阻擋病原菌進入腦組織,保護中樞神經系統；血胎屏障(blood-embryo barrier)： 母體子宮內膜和胎兒的絨毛膜,防止母體內的病原體進入胎兒。吞噬細胞的吞噬作用吞噬細胞：存在于血液、體液和組織中，能吞噬、殺死和消化病原菌的白細胞。多形核白細胞（polymorphonuclear leukocyte, PMN）； 粒細胞（granulocyte）：產生于骨髓,完全成熟后進入血流,是一類活動非常積極的重要細胞。急性炎癥反應中的重要吞噬細胞。包括嗜中性粒細胞（neutrophil）；嗜堿性粒細胞（basophil）；嗜酸性粒細胞（eosinophil）。 |
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| 巨噬細胞（macrophage, M.）：由骨髓干細胞分化而來,在組織中分布廣；肝臟、肺、網狀結締組織。吞噬和殺菌作用抗原遞呈作用：通過吞噬、處理和傳遞，對外來抗原物質進行加工，以適應激活淋巴細胞的需要；免疫調節作用：在外來抗原刺激下，產生多種可溶性生物活性物質，進行免疫調節；抗癌作用。炎癥反應：炎癥（inflammation）：機體對病原體的侵入或其他損傷的一種保護反應，在相應部位出現紅、腫、熱、痛和功能障礙。是病理過程，也是免疫反應。正常體液或組織中的抗菌物質：補體（complement）；干擾素（interferons, IFNs） 補體：是血清中的正常成分，有補充抗體作用的能力。有九種不同的成分C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8， C9；C1 包括C1q，C1r，C1s。被抗原抗體復合物激活后，可溶解和殺傷細胞，增強吞噬作用。動員大量吞噬細胞聚集在炎癥部位； 血流的加速使血液中抗菌因子和抗體發生局部濃縮； 死亡的宿主細胞堆積可釋放一部分抗菌物質； 炎癥中心部位氧濃度下降和乳酸濃度提高，可抑制多種病原體的生長； 炎癥部位體溫的升高可降低某些病原體的繁殖速度。 |
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| 第三節特異性免疫特異性免疫（specific immunity） 獲得性免疫（acquired immunity） 適應性免疫（adaptive immunity）：機體針對某一種或一類微生物或其產物所產生的特異性抵抗力，是后天獲得的。免疫應答（immune response）：發生在活生物體內的特異性免疫的系列反應過程。是抗原、抗體的特異性反應。抗原（ antigen, Ag ）； 免疫原（immunogen）：能刺激誘導機體發生免疫應答并能與相應抗體或T 淋巴細胞受體發生特異性免疫反應的大分子物質。免疫原性(immunogenicity)； 抗原性（antigenicity）。免疫反應性（immunoreactivity）； 反應原性(reactinogenicity)。半抗原（hapten）；不完全抗原（incomplete antigen）：只有反應原性，沒有免疫性。完全抗原由兩部分組成：載體(carrier):化學本質為蛋白質；半抗原。抗原的基本特性：具有一定化學組成和結構的大分子物質。異物性（foreignness）：抗原的理化性質與其所刺激的機體的自身物質理化性質之間的差異程度特異性：由分子表面上特定化學基團所決定（抗原決定簇，antigenic determinant）。抗體(antibody)：高等動物體在抗原物質的刺激下，由漿細胞產生的一類能與相應抗原在體內外發生特異性結合的免疫球蛋白。抗抗體（antiantibody）:具有抗體功能的抗原刺激機體產生的相應的抗體。 |
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| 抗體的結構五類抗體：IgG，IgA，IgM，IgD，IgE。 |
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| 抗體形成的規律： 兩次應答規律:初次免疫應答(primary immune response)；再次免疫應答(secondary immune response)。回憶反應抗體出現的順序:IgM 最早出現，IgA 最晚出現。影響抗體形成的因素： 抗原：是否按抗體形成的規律（親緣關系，注射次數)；機體：本身機體的差異。第四節免疫學方法及其應用抗原抗體反應的一般規律: 特異性：鑰匙和鎖；可逆性：Ag+Ab←→Ag·Ab； 定比性；階段性:特異性結合階段，可見反應階段；條件依賴性影響抗原抗體間反應的因素: 電解質溫度:溫度上升，促進分子運動，增加抗原抗體的碰撞機會；但溫度過高，抗原抗體解離、變性、破壞。一般最適溫度為37 ℃ PH:蛋白質為兩性電離性質，Ig 的等電點為PH=5～5.5。一般抗原抗體反應的PH 為6～8。抗原抗體間的主要反應： 凝集反應（agglutination） 直接凝集反應（direct agglutination）：顆粒性抗原（完整細菌細胞或血細胞） 與相應的抗體在合適的條件下反應并出現肉眼可見的凝集團現象。凝集原（agglutinogen）；凝集素（agglutinin）；稀釋抗體。 |
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| 定性：玻片法，已知抗體測未知抗原，如鑒定血型。 定量：試管法，已知抗原測未知抗體，診斷傷寒、肥達氏試驗（Widal test）。間接凝集反應（ indirect agglutination）：需要載體，吸附可溶性抗原，成為人工的顆粒性抗原。測微量抗體，以增加測量的靈敏度。間接凝集抑制反應：將可溶性抗原與抗體混合，充分作用后再加入載體吸附相應的抗體。若此時抗體已被抗原中和，則不再發生凝集。用于檢測抗原。如妊娠試驗：孕婦尿中有絨毛膜促性腺激素HCG(抗原)；尿＋HCG 抗體； 再加入HCG 覆蓋的紅細胞。若尿中有HCG，HCG 與HCG 抗體接合，樣品中無游離HCG 抗體。未出現沉淀，即發生凝集抑制，懷孕；出現沉淀，即未發生凝集抑制，未懷孕。 沉淀反應(precipitation)：可溶性抗原與其相應的抗體在合適的條件下反應， 并出現肉眼可見的沉淀物。沉淀原（precipitonogen）；沉淀素（precipitin）；稀釋抗原。環狀沉淀反應（ring precipitation） 環狀試驗（ring test）：用于抗原的定性；如鑒定血跡。絮狀沉淀反應（flocculation precipitation）：絮狀反應，抗原與相應抗體在試管中或凹玻片上混勻，經過一段時間后，出現肉眼可見的絮狀沉淀。如康氏試驗（Kahn test）診斷梅毒。瓊脂擴散法（agar diffusion） 免疫擴散法（immuno-diffusion）可溶性抗原與相應的抗體在半固體瓊脂內擴散并進行沉淀反應。單向瓊脂擴散（ simple agar diffusion ）定量測定抗原雙相瓊脂擴散（ double agar diffusion ）定性分析抗原或抗體對流免疫電泳（counter immuno-electrophoresis, CIE） 抗原和抗體分別置于凝膠板電場的正負極的小孔內，通電后抗原向正極移動而抗體向負極移動，在兩孔間合適的抗原抗體濃度處會形成一條沉淀線。雙相瓊脂擴散與電泳技術的結合。 40 華東理工大學《微生物學教程》上課講義火箭電泳法（rocket electrophoresis） 在已混有抗體的凝膠板上的小孔內加入抗原并進行電泳,在沿著電泳方向會形成火箭型沉淀線。已知標準抗原量可方便地測定未知標本中的抗原量。單相瓊脂擴散與電泳技術的結合。雙向免疫電泳(two dimentional immuno-electrophoresis) 免疫電泳與火箭點泳的結合。補體結合反應（complement fixation test） 有補體參與，并以綿羊紅細胞和溶血素（紅細胞的特異性抗體）是否發生溶血反應作指示的一種高靈敏度的抗原抗體的結合反應。2 個系統，5 種成分免疫熒光技術（immunofluorescens technique） 熒光抗體法(fluorescent antibody technique）：抗體與熒光素結合形成熒光抗體。免疫酶技術（ immunoenzymatic technique） 酶免疫測定法（enzyme immunoassay）: 用酶作標記的抗體或抗抗體，進行抗原抗體反應的高靈敏度的免疫標記技術。 |
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| 放射免疫測定法（radioimmuno-assay）：利用放射性同位素標記抗原或抗體。免疫反應的應用： 預防接種自動免疫和被動免疫的區別（見下表） 自動免疫被動免疫免疫產生較慢立即獲得免疫體內可持續產生抗體抗體量不超過注射量再接受抗原增加反應無增加反應維持時間較長維持時間較短用于預防用于應急用于治療:疫苗:類毒素(白喉類毒素、破傷風類毒素)；免疫血清（抗毒素、丙種球蛋白）；活疫苗：卡介苗，甲肝疫苗，脊髓灰質疫苗；死疫苗：百日咳，傷寒， 霍亂，乙腦，乙肝； 用于診斷；用于微生物分類。變態反應（allergy） 超敏反應（hypersensitivity）:機體受同一抗原物質再次刺激后產生的一種異常的或病理性的，以組織損傷或生理功能紊亂為表現的免疫反應。變應原（allergen）：完全抗原、半抗原完全抗原:異種血清蛋白，微生物，寄生蟲，花粉，魚，蝦。半抗原:青霉素半抗原進入機體與組織結合成為完全抗原。變態反應的發生：變應原的劑量；進入體內的途徑；機體免疫機能的狀態。過敏反應：變應原與固定在細胞（肥大細胞）上的特異性抗體結合，使細胞釋放過敏介質，從而引起效應器官生理功能紊亂。個體差異明顯；反應快，消失也快；反應發生重；抗體為IgE。 |
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| 青霉素過敏反應： 青霉素分子（β-內酰胺環中的羧基）直接與人體內蛋白中的氨基結合，形成青霉噻唑蛋白。青霉素降解產物（青霉烯酸）與人體蛋白質結合。防治變態反應： 檢出過敏原并避免接觸； 脫敏治療：小量多次注射某過敏原進行脫敏。例如：破傷風抗過敏藥物；抗組胺藥物：撲爾敏，息斯敏。 |
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