一、目的要求
　　學習與比較幾種菌種保藏的方法。

　　二、基本原理

　　微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態，才能在一定的時間內使其不發生變異而又保持生活能力。

　　低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據這三個因素而設計的。

　　保藏方法大致可分為以下幾種：

　　1．傳代培養保藏法

　　又有斜面培養、穿刺培養、皰肉培養基培養等（后者作保藏厭氧細菌用），培養后于4—6℃冰箱內保存。

　　2．液體石蠟覆蓋保藏法

　　是傳代培養的變相方法，能夠適當延長保藏時間，它是在斜面培養物和穿刺培養物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養基水分蒸發而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。

　　3．載體保藏法

　　是將微生物吸附在適當的載體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應用相當廣泛。

　　4．寄主保藏法

　　用于目前尚不能在人工培養基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內感染并傳代，此法相當于一般微生物的傳代培養保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進行保藏。

　　5．冷凍保藏法

　　可分低溫冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速凍結（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

　　6．冷凍干燥保藏法

　　先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現象除去水分（真空干燥）。

　　有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護劑來制備細胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對細胞的損害。保護性溶質可通過氫和離子鍵對水和細胞所產生的親和力來穩定細胞成分的構型。保護劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等。

　　三、器材

　　細菌、酵母菌，放線菌和霉菌；

　　肉膏蛋白胨斜面培養基，滅菌脫脂牛乳，滅菌水，化學純的液體石蠟，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黃土或紅土，冰塊、食鹽，干冰，95％酒精，10％鹽酸，無水氯化鈣；

　　滅菌吸管，滅菌滴管，滅菌培養皿，管形安瓿管，淚滴形安瓿管（長頸球形底），40目與 100目篩子，油紙，濾紙條（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空壓力表，噴燈，L形五通管，冰箱，低溫冰箱（-30℃），液氮冷凍保藏器。

　　四、操作步驟、各保藏法的應用范圍及優缺點

　　下列各法可根據實驗室具體條件與需要選做。

　　1．斜面低溫保藏法

　　將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。

　　保藏時間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2—4個月，移種一次。酵母菌兩個月，細菌最好每月移種一次。

　　此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法，優點是操作簡單，使用方便，不需特殊設備，能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點是容易變異，因為培養基的物理、化學特性不是嚴格恒定的，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機會亦較多。

　　2．液體石蠟保藏法

　　（1）將液體石蠟分裝于三角燒瓶內，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發掉，備用。

　　（2）將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養基中培養，使得到健壯的菌體或孢子。

　　（3）用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準（圖Ⅶ-12），使菌種與空氣隔絕。

　　（4）將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長）。

　　此法實用而效果好。霉菌、放線菌、芽孢細菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般無芽孢細菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內，亦可保藏3個月之久。此法的優點是制作簡單，不需特殊設備，且不需經常移種。缺點是保存時必須直立放置，所占位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養物移種后，接種環在火焰上燒灼時，培養物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應特別注意。

　　3．濾紙保藏法

　　（1）將濾紙剪成0．5×1．2cm的小條，裝入0．6×8cm的安瓿管中，每管1—2張，塞以棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘。

　　（2）將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養基上培養，使充分生長。

　　（3）取滅菌脫脂牛乳1—2ml滴加在滅菌培養皿或試管內，取數環菌苔在牛乳內混勻，制成濃懸液。

　　（4）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

　　（5）將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。

　　（6）將棉花塞入管內，用火焰按圖Ⅶ-13熔封，保存于低溫下。

　　（7）需要使用菌種，復活培養時，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養基內，置溫箱中培養。

　　細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14—17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設備。

　　4．沙土保藏法

　　（1）取河沙加入10％稀鹽酸，加熱煮沸30分鐘，以去除其中的有機質。

　　（2）倒去酸水，用自來水沖洗至中性。

　　（3）烘干，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。

　　（4）另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數次，直至中性。

　　（5）烘干，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。

　　（6）按一份黃土、三份沙的比例（或根據需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）摻合均勻，裝入10×100mm的小試管或安瓿管中，每管裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌，烘干。

　　（7）抽樣進行無菌檢查，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養基中，37℃培養48小時，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌，方可備用。

　　（8）選擇培養成熟的（一般指孢子層生長豐滿的，營養細胞用此法效果不好）優良菌種，以無菌水洗下，制成孢子懸液。

　　（9）于每支沙土管中加入約0．5ml（一般以剛剛使沙土潤濕為宜）孢子懸液，以接種針拌勻。

　　（10）放入真空干燥器內，用真空泵抽干水分，抽干時間越短越好，務使在12小時內抽干。

　　（11）每10支抽取一支，用接種環取出少數沙粒，接種于斜面培養基上，進行培養，觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現雜菌或菌落數很少或根本不長，則說明制作的沙土管有問題，尚須進一步抽樣檢查。

　　（12）若經檢查沒有問題，用火焰熔封管口，放冰箱或室內干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。

　　（13）需要使用菌種，復活培養時，取沙土少許移入液體培養基內，置溫箱中培養。

　　此法多用于能產生孢子的微生物如霉菌、放線菌，因此在抗生素工業生產中應用最廣，效果亦好，可保存2年左右，但應用于營養細胞效果不佳。

　　5．液氮冷凍保藏法

　　（1）準備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液體的。

　　（2）加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細胞時，則將空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內預先加入保護劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌15分鐘。

　　（3）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內切取菌落圓塊，放入含有保護劑的安瓿管內，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。

　　（4）凍結再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結至-30℃。若細胞急劇冷凍，則在細胞內會形成冰的結晶，因而降低存活率。

　　（5）保藏經凍結至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器（圖Ⅶ-14）的小圓筒內，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內。液氮保藏器內的氣相為-150℃，液態氮內為-196℃。

　　（6）恢復培養保藏的菌種需要用時，將安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中進行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內容物移入適宜的培養基上培養。

　　此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點是需要特殊設備。

　　6．冷凍干燥保藏法

　　（1）準備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管（圖Ⅶ-15），大小要求外徑6—7．5mm，長105mm，球部直徑9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘，備用。

　　（2）準備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達數年至十數年，為了在許多年后不出差錯，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養基中用最適溫度培養，使培養出良好的培養物。細菌和酵母的菌齡要求超過對數生長期，若用對數生長期的菌種進行保藏，其存活率反而降低。一般，細菌要求24—48小時的培養物；酵母需培養3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養7—10天。

　　（3）制備菌懸液與分裝以細菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0．2ml。

　　（4）冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達到同樣的目的。

　　將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2>）酒精液或干冰丙酮液，溫度可達-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4—5分鐘，即可使懸液結冰。

　　（5）真空干燥為在真空干燥時使樣品保持凍結狀態，需準備冷凍槽，槽內放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內。

　　抽氣一般若在30分鐘內能達到93．3Pa（0．7mmHg）真空度時，則干燥物不致熔化，以后再繼續抽氣，幾小時內，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持壓力6—8小時即可。

　　（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（圖Ⅶ-17）繼續抽氣，約10分鐘即可達到26．7Pa（0．2mmHg）。于真空狀態下，以煤氣噴燈的細火焰在安瓿管頸中央進行封口。封口以后，保存于冰箱或室溫暗處。

　　此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對一般生活力強的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用，即使對一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存，一般可保存數年至十余年，但設備和操作都比較復雜。

(7)細菌保存于穿刺培養物中：一般細菌保存于穿刺培養物可以維持兩年。具體方法如下：用滅菌接種針挑取分散良好的單菌落，針緩慢穿過瓊脂到達瓶底，連續幾次，蓋上瓶蓋擰緊，做好標記。室溫下存放于暗處。（最好一點可以將瓶蓋放松，在適當溫度下培養過夜，再擰緊瓶蓋并加封Parafilm膜，室溫或最好在4度避光保存）。

(8)細菌保存于含有甘油的培養物中：
1>：在液體培養基中生長的細菌培養物：取0.85ml細菌培養物，加入0.15ml高壓滅菌甘油，振蕩培養物使甘油分布均勻，然后轉移到標記好的保存管內，密封，在乙醇－干冰或液氮中凍結后再轉至－70度長期保存。在復蘇時，用滅菌接種針刮取凍結的培養物表面，然后立即把黏附于接種針上的細菌劃于含適當抗生素的LB瓊脂平板表面，于37度過夜。
2>：在瓊脂平板上生長的細菌培養物：從瓊脂平板表面刮下細菌放入裝有2mlLB的無菌試管內，再加入等量的含有30％滅菌甘油的LB培養基，振蕩使甘油完全分布均勻后，分裝于無菌保存管內，密封，再按前述方法冰凍保存。這一方法的優點在于可用于保存在質粒載體上建立的cDNA文庫。