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細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4 oC 冰箱,避免光照,實驗進行前放在37 oC 水槽中溫熱。
2. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個月,期間glutamine 可能會分解,若細胞生長不佳,可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例):
3.1. 細胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清,因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml,pH 為 7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加,若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成 pH 之誤差,或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合,然后用CO2 氣體調(diào)整pH,而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH),因為氯離子對細胞生長可能有影響,且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。
3.2. 材料:
3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水,水品質(zhì)非常重要)
3.2.2. 粉末培養(yǎng)基
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟:
3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中,攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異,表一)溶于200ml milli-Q 水中,攪拌使其溶解,然后通入CO2 氣體至飽和,約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。混后溶液之pH 應(yīng)為7.2-7.4,除非pH 值偏差太大,否則不需用酸堿再調(diào)整之。
若為太堿,可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時,pH 會升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌,同時分裝至無菌容器中,標示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等,貯存于4 oC。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)
3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。
4. 配制培養(yǎng)基之生長測試
4.1. 材料:
4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
4.2. 步驟:
4.2.1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell,接種MDCK 細胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中,每個well 接種1 × 102 活細胞,同時作對照組實驗。
4.2.2. 接種5~7 天后,在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長,待細胞群落大到可以肉眼觀察,而群落間不互相接觸時即可。
4.2.3. 去除培養(yǎng)基,加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1),室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液,水洗二次。
4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution,,室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液,水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計數(shù)群落數(shù),并比較之,若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細胞生長不佳,則丟棄之。
 
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