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結(jié)晶紫染色測(cè)定細(xì)胞數(shù)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

1.在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加0.1ml含5×104~10×4 WEHI-164細(xì)胞的培養(yǎng)液(含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液),37℃ 5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3小時(shí),讓細(xì)胞帖壁。

2.用RPMI-1640培養(yǎng)液10倍遞次稀釋TNF標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)需要3~5倍遞次稀釋待檢樣品,每孔加0.1ml稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣品,每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)孔。對(duì)照孔6個(gè),3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培養(yǎng)液,3個(gè)陰性對(duì)照孔各加100μl RPMI-1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)18~24小時(shí)。

3.甩去培養(yǎng)液,用PBS小心洗滌一次,每孔加0.1ml 10%甲醇溶液固定細(xì)胞30秒鐘。

4.吸去甲醇溶液,每孔加0.1ml結(jié)晶紫染液,室溫中放置20分鐘。

5.輕輕甩去染色液,用蒸餾水洗滌各孔,將培養(yǎng)板倒置于吸水紙上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室溫中長(zhǎng)期保存。

6.測(cè)定前,每孔加0.1ml 33%醋酸脫色,充分振蕩后在570nm處測(cè)定光吸收度。用光吸收度(OD)值對(duì)樣品稀釋度作圖,比較標(biāo)準(zhǔn)品曲線(xiàn)和待檢樣品曲線(xiàn)即可得到待測(cè)樣品中的細(xì)胞因子活性

 

 
鏇村

 

 
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