1 PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測(cè)
PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生, 可能作為免疫系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)志。AnnexinV,一個(gè)鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白,能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS,再通過(guò)簡(jiǎn)單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測(cè)(懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用),可與DNA染料或別的晚期檢測(cè)方法相結(jié)合來(lái)標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。
美國(guó)著名生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分別開(kāi)發(fā)了多種標(biāo)記的Annexin V產(chǎn)品,簡(jiǎn)便快速,10分鐘就可完成檢測(cè)。其中帶熒光標(biāo)記的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC,靈敏度高,可作為FACS(流式細(xì)胞分選)方法篩選凋亡細(xì)胞的基礎(chǔ)。由于融合蛋白Annexin V-EGFP,EGFP與PS 的結(jié)合比例為1:1,還可進(jìn)行定量檢測(cè)。除此之外,還提供生物素偶聯(lián)的Annexin V,可通過(guò)常用的酶聯(lián)顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。另外,MACS公司將磁珠包被Annexin V,可采用磁分選方法篩選凋亡細(xì)胞。
2 細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè)
這反應(yīng)了細(xì)胞凋亡研究中相對(duì)較新的趨勢(shì),研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過(guò)熒光染料monochlorobimane(MCB)體外檢測(cè)凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來(lái)檢測(cè)凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。正常狀態(tài)下,谷光苷肽(glutathione:GSH)作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過(guò)被GSH還原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要,許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細(xì)胞中,細(xì)胞膜中有可被凋亡信號(hào)啟動(dòng)的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非常活躍時(shí),細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境,這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低,從而使細(xì)胞色素C(三羧酸循環(huán)中的重要組分)從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中,啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān),此項(xiàng)檢測(cè)除了對(duì)研究細(xì)胞凋亡的起始非常有用外,還可用于心臟病、中風(fēng)等疾病治療的研究。但有些細(xì)胞如:HeLa 和3T3細(xì)胞凋亡時(shí)沒(méi)有明顯的GSH水平的變化,不能用此法檢測(cè)。
3 細(xì)胞色素C的定位檢測(cè)
細(xì)胞色素C作為一種信號(hào)物質(zhì),在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下,它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中,凋亡信號(hào)刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞液,結(jié)合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng):細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase。細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ:COX4)是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白,凋亡發(fā)生時(shí),它保留在線粒體內(nèi),因而它是線粒體富集部分的一個(gè)非常有用的標(biāo)志。
ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心,可從凋亡和非凋亡細(xì)胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分,再進(jìn)一步通過(guò)Western雜交用細(xì)胞色素C抗體和COX4抗體標(biāo)示細(xì)胞色素C和COX4的存在位置,從而判斷凋亡的發(fā)生。
4 線粒體膜電位變化的檢測(cè)
在凋亡研究的早期,從形態(tài)學(xué)觀測(cè)上線粒體沒(méi)有明顯的變化。隨著凋亡機(jī)制研究的深入,發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細(xì)胞凋亡的重要組成部分,發(fā)生很多生理生化變化。例如,在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會(huì)發(fā)生變化,導(dǎo)致膜穿透性的改變。MitoSensorTM,一個(gè)陽(yáng)離子性的染色劑,對(duì)此改變非常敏感,呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中,它在線粒體中形成聚集體,發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中,因線粒體穿膜電位的改變,它以單體形式存在于細(xì)胞液中,發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號(hào)。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。但是,這種方法不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木粒體膜電位的變化。