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細胞培養(yǎng)常見問題

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基?

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之,首選MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始,各種目的無血清培養(yǎng)最好首選AIM V(12005)培養(yǎng)基(SFM)。

L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?

L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩(wěn)定?

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞?

用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200~2000個/毫升,在0.1毫升的細胞懸液中加入0.1毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數(shù)分鐘后,用血球計數(shù)板計數(shù)細胞。活細胞排斥臺盼蘭,因而染成藍色的細胞是死細胞。

如何消除組織培養(yǎng)的污染?

當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

1. 在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞,稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。
2. 分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi),把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
3. 每天觀測細胞毒性指標(biāo),如脫落,出現(xiàn)空泡,匯合度下降和變圓。
4. 確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2~3代。
5. 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。
6. 重復(fù)步驟4。
7. 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~6代,確定污染是否以已被消除。


培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?

丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。

二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

我試用SF900 II時,細胞生長良好,但是我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好。

如果目的蛋白是一個后期蛋白,它將與蛋白酶一起表達,這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中,這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白,從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題,加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清(少于1%),讓血清給蛋白酶提供作用底物。

20°C下配制的緩沖液,在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎?

對于普通使用的緩沖液,PH值隨溫度變化而變化。

下表列出溫度改變10℃時,PH值的變化情況:

例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-(2x0.310)=6.78

緩沖系統(tǒng) pKa/20℃ [ Delta]pKa/10℃

Mes 6.15 -0.110
Ada 6.60 -0.110
Pipes 6.80 -0.085
Aces 6.90 -0.200
Bes 7.15 -0.160
Mops 7.20 -0.013
Tes 7.50 -0.200
Hepes 7.55 -0.140
Tricine 8.15 -0.210
Tris 8.30 -0.310
Bicine 8.35 -0.180
Glycylglycine 8.40 -0.280


室溫下(25?)配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用時PH值是多少?

緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時,不同的PH值。

4°C 25°C 37°C
8.1 7.5 7.2
8.2 7.6 7.3
8.3 7.7 7.4
8.4 7.8 7.5
8.5 7.9 7.6
8.6 8.0 7.7
8.7 8.1 7.8
8.8 8.2 7.9
8.9 8.3 8.0
9.0 8.4 8.1
9.1 8.5 8.2
9.2 8.6 8.3
9.3 8.7 8.4
9.4 8.8 8.5


昆蟲細胞培養(yǎng)的最適PH值和滲透壓是多少?

生長培養(yǎng)基的PH值對細胞的增殖和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會產(chǎn)生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系,在PH值 6.0~6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細胞系時,培養(yǎng)基的最適滲透壓是345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養(yǎng)方式,減少技術(shù)問題,保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。

High Five細胞有任何其它名稱嗎?

High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別

PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白質(zhì)的單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。如果作為雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基使用,PFHM-II可能需要補充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM既是雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基,也是單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。它包含低水平的蛋白質(zhì)。

在High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少?

High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度:0.025 g/L Tween-80,1.0 g/L Pluronic Poly-all。

High Five細胞用多大的密度凍存?

3.0x10E6 cells/ml。

在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀,加熱后溶解。它是什么?對我的細胞有害嗎?

可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復(fù)合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解,對實驗不會有不利的影響。

如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細胞?能用胰蛋白酶消化嗎?

強力推薦使用脫落細胞的方法,因為這項技術(shù)破壞性最小,生活力最高。正如手冊上所顯示,通過使用巴斯德吸液管,讓細胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對必要的情況下,才使用胰酶消化細胞。

胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞: 1. 去除培養(yǎng)基。
2. 用2ml 1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞,去除PBS。
3. 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。
4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。
5. 向細胞中加入2ml 細胞培養(yǎng)液,移入錐形管,用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。)
6. 離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養(yǎng)基。
7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細胞。傳代。


在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養(yǎng)時,肝素的使用量是多少?

為了防止懸浮培養(yǎng)細胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。

在重新凍存sf9細胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數(shù)的增加,它的感染能力會降低嗎?

通常情況當(dāng)細胞經(jīng)過30次傳代后,應(yīng)該返回凍存。無論什么時候計數(shù)時,都應(yīng)該檢查細胞活力。如果超過95%的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍,細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降,它們的感染力將不在是有效的。

 
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