一、基本原理
某些物質的分子能吸收能量而發射出熒光，根據熒光的光譜和熒光強度，對物質進行定性或定量的方法，稱為熒光分析法（fluorescence analysis）。
熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強、需樣量少和方法簡便等優點，它的測定下限通常比分光光度法低2~4個數量級，在生化分析中的應用較廣泛。
在室溫下分子大都處在基態的最低振動能級，當受到光的照射時，便吸收與它的特征頻率相一致的光線，其中某些電子由原來的基態能級躍遷到第一電子激發態或更高電子激發態中的各個不同振動能級，這就是在分光光度法中所述的吸光現象。躍遷到較高能級的分子，很快（約10-8s）因碰撞而以熱的形式損失部分能量，由所處的激發態能級下降到第一電子激發態的最低振動能級，能量的這種轉移形式，稱為無輻射躍遷。由第一電子激發態的最低振動能級下降到基態的任何振動能級，并以光的形式放出它們所吸收的能量，這種光便稱為熒光。

熒光分析法是測定物質吸收了一定頻率的光以后，物質本身所發射的光的強度。物質吸收的光，稱為激發光；物質受激后所發射的光，稱為發射光或熒光。如果將激發光用單色器分光后，連續測定相應的熒光的強度所得到的曲線，稱為該熒光物質的激發光譜（excitation spectrum）。實際上熒光物質的激發光譜就是它的吸收光譜。在激發光譜中最大吸收處的波長處，固定波長和強度，檢測物質所發射的熒光的波長和強度，所得到的曲線稱為該物質的熒光發射光譜，簡稱熒光光譜（fluorescence spectrum）。在建立熒光分析法時，需根據熒光光譜來選擇適當的測定波長。激發光譜和熒光光譜是熒光物質定性的依據。

對于某一熒光物質的稀溶液，在一定波長和一定強度的入射光照射下，當液層的厚度不變時，所發生的熒光強度和該溶液的濃度成正比，這是熒光定量分析的基礎。

二、熒光儀的主要部件
測定熒光可用熒光計和熒光分光光度計，二者的結構復雜程度不同，但其基本結構是相似的。由光源發出的光，經單色器讓特征波長的激發光通過，照射到液槽使熒光物質發射出熒光，經第二個單色器讓待測物質所產生的特征波長熒光通過，照射到檢測器產生光電流，經放大后以指針指示或用記錄儀記錄其信號。

儀器的主要部件如下：
1．光源：發射紫外區和可見區的激發光，一般常用的為溴鎢燈和供蒸汽燈，以及氙弧燈。
2．單色器：儀器共有兩個單色器，作用分別是濾去非特征波長的激發光，和濾去非特征波長熒光的雜散光。
3．液槽：用來盛放待測溶液。
4．檢測器：檢測待測物質所發射的熒光信號。

三、熒光分析法的定性和定量
（一）定性分析
熒光物質特性的光譜包括激發光譜和熒光光譜兩種。在分光光度法中，被測物質只有一種特征的吸收光譜，而熒光分析法能測出兩種特征光譜，因此，鑒定物質的可靠性較強。當然，必須在標準品對照下進行定性。

（二）定量測定
熒光分析法的定量測定方法較多，可分為直接測定法和間接測定法兩類。
1、直接測定法：
利用熒光分析法對被分析物質進行濃度測定，最簡單的便是直接測定法。某些物質只要本身能發熒光，只須將含這類物質的樣品作適當的前處理或分離除去干擾物質，即可通過測量它的熒光強度來測定其濃度。具體方法有兩種。

（1）直接比較法：配制標準溶液的熒光強度Fx，已知標準溶液的濃度Cs，便可求得樣品中待測熒光物質的含量。
如果空白溶液的熒光強度調不到零，則必須從Fs和Fx值中扣除空白溶液的熒光強度F0，然后進行計算。

（2）標準曲線法：將已知含量的標準品經過和樣品同樣處理后，配成一系列標準溶液，測定其熒光強度，以熒光強度對熒光物質含量繪制標準曲線。再測定樣品溶液的熒光強度，由標準曲線便可求出樣品中待測熒光物質的含量。
為了使各次所繪制的標準曲線能重合一致，每次應以同一標準溶液對儀器進行校正。如果該溶液在紫外光照射下不夠穩定，則必須改用另一種穩定而熒光峰相近的標準溶液來進行校正。例如，測定維生素B1時，可用硫酸奎寧溶液作為基準；測定維生素B2時，可用熒光素鈉溶液作為基準來校正儀器。

2、間接測定法：
有許多物質，它們本身不能發熒光，或者熒光量子產率很低，僅能顯現非常微弱的熒光，無法直接測定，這時可采用間接測定方法。
間接測定方法有以下幾種：
（1）化學轉化法：通過化學反應將非熒光物質變為適合于測定的熒光物質。例如金屬與螯合劑反應生成具有熒光的螯合物。有機化合物可通過光化學反應、降解、氧化還原、偶聯、縮合或酶促反應，使它們轉化為熒光物質。

（2）熒光猝滅法：這種方法是利用本身不發熒光的被分析物質能使某種熒光化合物的熒光猝滅的性質，通過測量熒光化合物熒光強度的下降，間接地測定該物質的濃度。

（3）敏化發光法：對于很低濃度的分析物質，如果采用一般的熒光測定方法，其熒光信號太弱而無法檢測，可使用一種物質（敏化劑）以吸收激發光，然后將激發光能傳遞給發熒光的分析物質，從而提高被分析物質測定的靈敏度。

上述三種方法均為相對測定方法，在實驗時須采用某種標準進行比較。

四、減小測量誤差的方法
（1）溶劑：溶劑能影響熒光效率，改變熒光強度，因此，在測定時必須用同一溶劑。

（2）濃度：在較濃的溶液中，熒光強度并不隨溶液濃度呈正比增長。因此，必須找出與熒光強度呈線性的濃度范圍。

（3）酸度：熒光光譜和熒光效率常與溶液的酸度有關，因此，須通過條件試驗，確定最適宜的pH值范圍。

（4）溫度：熒光強度一般隨溫度降低而提高，因此，有些熒光儀的液槽配有低溫裝置，使熒光強度增大，以提高測定的靈敏度。在高級的熒光儀中，液槽四周有冷凝水并附有恒溫裝置，以便使溶液的溫度在測定過程中盡可能保持恒定。

（5）時間：有些熒光化合物需要一定時間才能形成；有些熒光物質在激發光較長時間照射下會發生光分解。因此，過早或過晚測定熒光強度均會帶來誤差。必須通過條件試驗確定最適宜的測定時間，使熒光強度達到量大且穩定。為了避免光分解所引起的誤差，應在熒光測定的短時間內才打開光閘其余時間均應關閉。

（6）共存干擾物質 有些干擾物質能與熒光分子作用使熒光強度顯著下降，這種現象稱為熒光的猝滅（quenching）；有些共存物質能產生熒光或產生散射光，也會影響熒光的正確測量。故應設法除去干擾物，并使用純度較高的溶劑和試劑。