（一）免疫球蛋白的提取
（二） 熒光素
1． 熒光色素的基本條件
（1） 具有化學活性基團，如異硫氰基（-NCS）等，易與免疫球蛋白結合形成共價鍵。
（2） 對免疫球蛋白無毒性，不影響抗體活性。
（3） 熒光效應高，與蛋白結合需要量少。
（4） 熒光素性能穩定，結合物性能穩定，容易貯藏。
（5） 結合物的顏色必須與背景組織有良好的反襯作用，易于觀察判定。
到目前為止，基本符合上述要求的熒光素只有異硫氰酸熒光素（FITC），麗絲胺羅丹明B200（RB200）。
2．常用的熒光色素
（1）異硫氰酸熒光素 ：又稱異硫氰酸熒光黃，純品為橙黃色粉末。分有結晶型與粉末型兩種,結晶型熒光強度大、穩定、優于粉末型。分子式C21H11O2N5、分子量389，溶于水，易溶于pH8-9.5碳酸鹽緩沖液中。最大吸收波長為495nm。最大發射波長520nm。異硫氰酸熒光黃性質穩定，于低溫下可保存二年以上，但久置標記抗體能力弱，熒光亮度差，故應采用新產品。
異硫氰酸熒光素借助異硫氰基與蛋白中氨基酸（主要是賴氨酸）的氨基結合。一個IgG分子有86個氨基酸殘基，一般最多能標記16～20個熒光素分子。
（2）麗絲胺羅丹明：為褐色粉末，不溶于水、易溶于酒精和丙酮。熒光為桔紅色。性質穩定，可長期保存。分子式C23H29O7NaS2，分子量為580，最大吸收波長570nm，最大發射波長為600nm。
由于麗絲胺羅丹明熒光效能較低，一般不單獨使用，多用于與FITC標記抗體的反襯染色或雙標記配合使用。此染料不能直接與蛋白質結合，必須先用五氯化磷（PCl5）處理，使染料的-SO3Na基變為-SO3Cl基后，才能在堿性條件下與賴氨酸的氨基結合，形成穩定的硫氨鍵。
（三） 標記方法
異硫氰酸熒光素常用的標記法有以下兩種：
1． 攪拌法
（1）取一定量的純IgG液，用0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋至20mg/ml。
（2）按熒光素與蛋白質比1︰20～1︰100（一般用1︰100）稱取異硫氰酸熒光素，用pH9.5碳酸鹽緩沖液溶解。
（3）將球蛋白液置于電磁攪拌器上，啟動開關，輕輕攪拌，以不起沫為準。逐滴加入熒光素液（約10min～15min加完）。加完后，隨時用試紙測定攪拌液的pH值，若低于9.0，則應以碳酸鈉溶液調整。置4℃攪拌6h～12h即可。
2． 透析法
（1）將IgG液以0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。
（2）將熒光素配成0.1mg/ml，其量為1%蛋白液的10倍，裝入燒杯中。
（3）將透析袋置于燒杯中，放電磁攪拌器上4℃攪拌24即可。
透析法的優點是標記均勻，非特異性熒光少，但所標記的時間長，熒光素的用量多，約比攪拌法多10倍。
3．影響標記的因素
（1）熒光素與蛋白質的比值：這也取決于熒光素的質量與保存期。一般而言，粉末狀熒光素以0.025mg/mg～0.05mg/mg蛋白質為宜，而結晶型則只需0.006mg/mg～0.008mg/mg蛋白質即可。
蛋白含量以20mg～25mg/ml為宜，濃度過低標記過慢。濃度過高，標記效果不好。不過在實踐中，以稍高一些蛋白濃度為好。
（2）pH值：以pH9.0～9.5為最好。過低標記速度慢，過高蛋白質容易變性。
（3）溫度和時間：溫度4℃～25℃均可。溫度與時間是成正比的，溫度低，反應慢，溫度高，反應快。4℃需要6h～12h，7℃～9℃需要3h～4h，20℃～25℃只需要1h～2h。實踐中可自選。透析法還是以4℃較長時間反應為好。
（4）熒光素的質量及有效期。
（四）標記抗體的純化
標記后溶液是一個混合體，它包括蛋白質與熒光素的結合體，還有游離的熒光素、游離的蛋白質以及結合過多的蛋白質。對于某些細菌性的診斷熒光抗體，則只要去除游離的熒光素即可。對于一般組織染色熒光抗體，則要去除過度標記的抗體即可。只是對某些特殊要求的組織染色試劑，則必須經過仔細的處理，包括具有特異性交叉反應或非特異性反應性的除去。
1． 去除游離的熒光素
（1）透析法：將標記好的抗體放入透析袋中于0.01Mol/L pH7.6 PBS中或生理鹽水中4℃透析數天，每天換液數次，直至透析液中無游離色素為止。通常約需5～7天才能透析完畢。
（2）凝膠過濾：以G25或G50葡聚糖凝膠裝柱進行過濾。次法速度快，一般1h～2 h即可完成。也可以先透析4h～5h，讓大部分游離熒光素除去，再過G25或G50柱。
2． 去除過度標記的蛋白質分子 可采用DEAE—纖維素過柱法。利用階梯洗脫法進行，具體方法如下：
（1）以0.01Mol/L pH 7.6 PB液洗脫。
（2）以0.01 Mol/L pH 7.6 PBS液（0.05Mol/L NaCl）洗脫。
（3）以0.01 Mol/L pH7.6 PBS（0.1Mol/L NaCl）洗脫。
（4）以0.01 Mol/L PH 7.6PBS（0.2Mol/L NaCl）洗脫。
收集每部分有熒光抗體的洗脫液管，于495nm測熒光素的OD值，再于280nm測蛋白的OD值，查標準曲線，算出各管熒光素和蛋白質的濃度，并計算出F/P比值（見后介紹），將合格者合并，濃縮后分裝小瓶備用。
層析柱上滯留的過度標記的蛋白質，可用1 Mol/L 的NaCl洗脫。
3．去除交叉反應等非特異性染色因素 非特異性染色的干擾因素，包括免疫血清的不純、類屬抗原以及熒光色素的質量不高、標本處理不當等。可以以臟粉進行吸收。具體做法如下：于每ml標記抗體中加入臟器干粉（臟粉制法見附錄）100mg，充分混合，于室溫中振蕩約1 h，然后以10 000 r/min離心30min，吸取標記抗體。必要時可減半臟粉用量再處理一次。
經過臟粉吸收后的熒光抗體必須加0.1%疊氮鈉防腐（注意不能加硫柳汞，因為重金屬對熒光素有影響）。分裝小瓶冷凍保存。
（五）標記抗體的鑒定
1．F/P比值鑒定 熒光色素與球蛋白的結合率即為F/P比值。分別制備熒光色素與蛋白質的標準曲線。
異硫氰酸熒光素的標準曲線是以0.5Mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液分別配成0.25μg/ml、0.5μg/ml.、0.75μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml……10.0 μg/ml的濃度，在495nm波長測其OD值，按重量與OD值在坐標上制成標準曲線。
蛋白的標準曲線是將牛血清蛋白分別配成0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.4 mg/ml…1.6mg/ml，在280nm測其OD值，并繪制成曲線。按以下公式計算F/P比值：
1．6× 104 FITCμg/ml FITCμg/ml
F/P（克分子比值）= × =0.41 ×
390 抗體mg/ml 抗體mg/ml
式中1·6×104為抗體蛋白質的分子量，390為異硫氰酸熒光素分子量。
F/P克分子比值以1～2為合適，1～3.5為合格。比值過低敏感性差，比值過高，易出現非特異性反應。用于檢查組織細胞抗原成分，F/P以1～2為好；用于檢查細菌涂片時，F/P以2～3為好。
2． 免疫電泳測定 通過免疫電泳可以測定熒光抗體的免疫純度。要求在球蛋白的部位上只出現一條沉淀線。
3．染色性能的鑒定 包括測定熒光抗體的敏感性與特異性。
（1）熒光抗體效價的測定：將熒光抗體倍比稀釋，然后用已知抗原制片，分別用各稀釋度去染色，觀察“ ”熒光強度的最大稀釋倍數即為該熒光抗體的染色滴度（或單位）。實際應用時則取2個或3個單位做應用的稀釋度。
（2）熒光抗體的特異性試驗：為了確保熒光抗體的特異性，必須預先進行下列試驗。①陽性標本染色試驗：即用所制熒光抗體去染色已知的相應的抗原，結果應是陽性；②陰性標本染色試驗：即用所制熒光抗體去染色已知的非相應抗原，結果應是陰性；③類屬性抗原染色試驗：取與已知抗原相近的類屬抗原（如炭疽桿菌與枯草桿菌或類炭疽桿菌等），用熒光抗體染色，應為陰性，說明特異性強，如不同程度地出現有熒光，說明具有類屬反應，特異性不強等；④抗體吸收試驗：以過量的相應抗原加入熒光抗體中，感作2h~4h，4℃過夜，離心取上清再對相應抗原染色，應無熒光或熒光顯著消退；⑤染色阻抑試驗：用未標記的抗體對相應抗原進行染色，沖洗后，再用熒光抗體對相應抗原進行染色，結果觀察，應無熒光。阻抑試驗應注意抗體與抗原的相應比例，未標記抗體的比例過小，結果抗原結合有剩余，標記抗體仍能被結合而顯示出阻抑不全。當抗體比例過大，則抗體的一個結合點結合而表現出不牢固，極易被標記抗體所置換出來而又顯示出阻抑不全。
（二） 熒光素
1． 熒光色素的基本條件
（1） 具有化學活性基團，如異硫氰基（-NCS）等，易與免疫球蛋白結合形成共價鍵。
（2） 對免疫球蛋白無毒性，不影響抗體活性。
（3） 熒光效應高，與蛋白結合需要量少。
（4） 熒光素性能穩定，結合物性能穩定，容易貯藏。
（5） 結合物的顏色必須與背景組織有良好的反襯作用，易于觀察判定。
到目前為止，基本符合上述要求的熒光素只有異硫氰酸熒光素（FITC），麗絲胺羅丹明B200（RB200）。
2．常用的熒光色素
（1）異硫氰酸熒光素 ：又稱異硫氰酸熒光黃，純品為橙黃色粉末。分有結晶型與粉末型兩種,結晶型熒光強度大、穩定、優于粉末型。分子式C21H11O2N5、分子量389，溶于水，易溶于pH8-9.5碳酸鹽緩沖液中。最大吸收波長為495nm。最大發射波長520nm。異硫氰酸熒光黃性質穩定，于低溫下可保存二年以上，但久置標記抗體能力弱，熒光亮度差，故應采用新產品。
異硫氰酸熒光素借助異硫氰基與蛋白中氨基酸（主要是賴氨酸）的氨基結合。一個IgG分子有86個氨基酸殘基，一般最多能標記16～20個熒光素分子。
（2）麗絲胺羅丹明：為褐色粉末，不溶于水、易溶于酒精和丙酮。熒光為桔紅色。性質穩定，可長期保存。分子式C23H29O7NaS2，分子量為580，最大吸收波長570nm，最大發射波長為600nm。
由于麗絲胺羅丹明熒光效能較低，一般不單獨使用，多用于與FITC標記抗體的反襯染色或雙標記配合使用。此染料不能直接與蛋白質結合，必須先用五氯化磷（PCl5）處理，使染料的-SO3Na基變為-SO3Cl基后，才能在堿性條件下與賴氨酸的氨基結合，形成穩定的硫氨鍵。
（三） 標記方法
異硫氰酸熒光素常用的標記法有以下兩種：
1． 攪拌法
（1）取一定量的純IgG液，用0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋至20mg/ml。
（2）按熒光素與蛋白質比1︰20～1︰100（一般用1︰100）稱取異硫氰酸熒光素，用pH9.5碳酸鹽緩沖液溶解。
（3）將球蛋白液置于電磁攪拌器上，啟動開關，輕輕攪拌，以不起沫為準。逐滴加入熒光素液（約10min～15min加完）。加完后，隨時用試紙測定攪拌液的pH值，若低于9.0，則應以碳酸鈉溶液調整。置4℃攪拌6h～12h即可。
2． 透析法
（1）將IgG液以0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。
（2）將熒光素配成0.1mg/ml，其量為1%蛋白液的10倍，裝入燒杯中。
（3）將透析袋置于燒杯中，放電磁攪拌器上4℃攪拌24即可。
透析法的優點是標記均勻，非特異性熒光少，但所標記的時間長，熒光素的用量多，約比攪拌法多10倍。
3．影響標記的因素
（1）熒光素與蛋白質的比值：這也取決于熒光素的質量與保存期。一般而言，粉末狀熒光素以0.025mg/mg～0.05mg/mg蛋白質為宜，而結晶型則只需0.006mg/mg～0.008mg/mg蛋白質即可。
蛋白含量以20mg～25mg/ml為宜，濃度過低標記過慢。濃度過高，標記效果不好。不過在實踐中，以稍高一些蛋白濃度為好。
（2）pH值：以pH9.0～9.5為最好。過低標記速度慢，過高蛋白質容易變性。
（3）溫度和時間：溫度4℃～25℃均可。溫度與時間是成正比的，溫度低，反應慢，溫度高，反應快。4℃需要6h～12h，7℃～9℃需要3h～4h，20℃～25℃只需要1h～2h。實踐中可自選。透析法還是以4℃較長時間反應為好。
（4）熒光素的質量及有效期。
（四）標記抗體的純化
標記后溶液是一個混合體，它包括蛋白質與熒光素的結合體，還有游離的熒光素、游離的蛋白質以及結合過多的蛋白質。對于某些細菌性的診斷熒光抗體，則只要去除游離的熒光素即可。對于一般組織染色熒光抗體，則要去除過度標記的抗體即可。只是對某些特殊要求的組織染色試劑，則必須經過仔細的處理，包括具有特異性交叉反應或非特異性反應性的除去。
1． 去除游離的熒光素
（1）透析法：將標記好的抗體放入透析袋中于0.01Mol/L pH7.6 PBS中或生理鹽水中4℃透析數天，每天換液數次，直至透析液中無游離色素為止。通常約需5～7天才能透析完畢。
（2）凝膠過濾：以G25或G50葡聚糖凝膠裝柱進行過濾。次法速度快，一般1h～2 h即可完成。也可以先透析4h～5h，讓大部分游離熒光素除去，再過G25或G50柱。
2． 去除過度標記的蛋白質分子 可采用DEAE—纖維素過柱法。利用階梯洗脫法進行，具體方法如下：
（1）以0.01Mol/L pH 7.6 PB液洗脫。
（2）以0.01 Mol/L pH 7.6 PBS液（0.05Mol/L NaCl）洗脫。
（3）以0.01 Mol/L pH7.6 PBS（0.1Mol/L NaCl）洗脫。
（4）以0.01 Mol/L PH 7.6PBS（0.2Mol/L NaCl）洗脫。
收集每部分有熒光抗體的洗脫液管，于495nm測熒光素的OD值，再于280nm測蛋白的OD值，查標準曲線，算出各管熒光素和蛋白質的濃度，并計算出F/P比值（見后介紹），將合格者合并，濃縮后分裝小瓶備用。
層析柱上滯留的過度標記的蛋白質，可用1 Mol/L 的NaCl洗脫。
3．去除交叉反應等非特異性染色因素 非特異性染色的干擾因素，包括免疫血清的不純、類屬抗原以及熒光色素的質量不高、標本處理不當等。可以以臟粉進行吸收。具體做法如下：于每ml標記抗體中加入臟器干粉（臟粉制法見附錄）100mg，充分混合，于室溫中振蕩約1 h，然后以10 000 r/min離心30min，吸取標記抗體。必要時可減半臟粉用量再處理一次。
經過臟粉吸收后的熒光抗體必須加0.1%疊氮鈉防腐（注意不能加硫柳汞，因為重金屬對熒光素有影響）。分裝小瓶冷凍保存。
（五）標記抗體的鑒定
1．F/P比值鑒定 熒光色素與球蛋白的結合率即為F/P比值。分別制備熒光色素與蛋白質的標準曲線。
異硫氰酸熒光素的標準曲線是以0.5Mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液分別配成0.25μg/ml、0.5μg/ml.、0.75μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml……10.0 μg/ml的濃度，在495nm波長測其OD值，按重量與OD值在坐標上制成標準曲線。
蛋白的標準曲線是將牛血清蛋白分別配成0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.4 mg/ml…1.6mg/ml，在280nm測其OD值，并繪制成曲線。按以下公式計算F/P比值：
1．6× 104 FITCμg/ml FITCμg/ml
F/P（克分子比值）= × =0.41 ×
390 抗體mg/ml 抗體mg/ml
式中1·6×104為抗體蛋白質的分子量，390為異硫氰酸熒光素分子量。
F/P克分子比值以1～2為合適，1～3.5為合格。比值過低敏感性差，比值過高，易出現非特異性反應。用于檢查組織細胞抗原成分，F/P以1～2為好；用于檢查細菌涂片時，F/P以2～3為好。
2． 免疫電泳測定 通過免疫電泳可以測定熒光抗體的免疫純度。要求在球蛋白的部位上只出現一條沉淀線。
3．染色性能的鑒定 包括測定熒光抗體的敏感性與特異性。
（1）熒光抗體效價的測定：將熒光抗體倍比稀釋，然后用已知抗原制片，分別用各稀釋度去染色，觀察“ ”熒光強度的最大稀釋倍數即為該熒光抗體的染色滴度（或單位）。實際應用時則取2個或3個單位做應用的稀釋度。
（2）熒光抗體的特異性試驗：為了確保熒光抗體的特異性，必須預先進行下列試驗。①陽性標本染色試驗：即用所制熒光抗體去染色已知的相應的抗原，結果應是陽性；②陰性標本染色試驗：即用所制熒光抗體去染色已知的非相應抗原，結果應是陰性；③類屬性抗原染色試驗：取與已知抗原相近的類屬抗原（如炭疽桿菌與枯草桿菌或類炭疽桿菌等），用熒光抗體染色，應為陰性，說明特異性強，如不同程度地出現有熒光，說明具有類屬反應，特異性不強等；④抗體吸收試驗：以過量的相應抗原加入熒光抗體中，感作2h~4h，4℃過夜，離心取上清再對相應抗原染色，應無熒光或熒光顯著消退；⑤染色阻抑試驗：用未標記的抗體對相應抗原進行染色，沖洗后，再用熒光抗體對相應抗原進行染色，結果觀察，應無熒光。阻抑試驗應注意抗體與抗原的相應比例，未標記抗體的比例過小，結果抗原結合有剩余，標記抗體仍能被結合而顯示出阻抑不全。當抗體比例過大，則抗體的一個結合點結合而表現出不牢固，極易被標記抗體所置換出來而又顯示出阻抑不全。