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火箭電泳技術

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-06-27

(一)原理
抗原在含有抗體的凝膠中進行電泳,在電場作用下,抗原向一個方向移動,在移動的過程中,逐步與凝膠中的抗體結合而沉淀呈火箭狀。沉淀峰面積越大,說明抗原量越多,二者呈正相關,因此可用于抗原的定量測定。此法具有敏感性高、快速等優點。
(二)材料與試劑
1.0.05mol/L pH8.6巴比妥緩沖液配成2%的瓊脂。
2.抗原與抗體
3.其它材料同免疫電泳。
(三)操作方法
1.將2%瓊脂煮沸溶化后,放入60℃水浴箱中。
2.將適量的抗體用0.05mol/L pH8.6巴比妥緩沖液稀釋至瓊脂同樣的體積量,放入60℃水浴。
3.將兩者充分混合,立即倒成平板。
4.瓊脂板冷卻后在一側打孔,孔徑3mm,孔距6mm。
5.于孔內分別加入不同濃度的定量抗原。
6.電泳 孔端接負板。電流強度3mA/cm(或電壓10V/cm),電泳時間2h~10h。
7.停止電泳,將瓊脂板于生理鹽水中浸泡24h,中間換液數次。
8.染色、脫色、干燥同免疫電泳。
9.抗體最適量的測定 將已知抗原與抗體以不同濃度梯度進行方陣試驗,找出所形成的火箭狀沉淀線,輪廓清晰,前端尖窄而閉合的抗體最小量作為抗體的最適用量。
10.標準曲線的繪制 以抗體的最適用量制成瓊脂板,分別用已知的不同濃度抗原(同一濃度的也必須做一批,以求平均值)進行電泳,泳畢后染色,測其沉淀峰的高度(或面積),然后以抗原量為縱軸,沉淀峰高度(或面積)為橫軸,制成標準曲線。
11.對照組的設置 在測未知抗原的同時,必須設置已知標準抗原作為電泳對照。
(四)結果判定
在已知標準抗原所形成的沉淀峰的高度,在許可的誤差范圍內,測其待測抗原所形成的沉淀峰的高度(或面積),然后從標準曲線中查出它們相應的抗原含量。
(五)注意事項
1.抗原抗體的用量應當預試,抗原太濃,在一定時間內不能達到最高峰,抗體太濃,則沉淀峰太低而無法測量。預試峰的合適高度為2cm~5cm。
2.用優質瓊脂糖。
3.一定條件下,電泳時間要根據峰的形成情況而定。如形成尖角峰形,表示已無游離抗原。如呈鈍圓形,前面有云霧狀,表示還未到終點。
4.把瓊脂板置于電泳槽上搭好橋,再加抗原,或啟動電源后,電壓極低時加樣,以免造成基部過寬的峰型。

 
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