抗原提純與動物免疫

　　對抗原的要求是純度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如為細胞抗原，可取1×107個細胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐劑并經充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動物免疫。

　　選擇與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8～12周，雌雄不限。為避免小鼠反應而不佳或免疫過程中死亡，可同時免疫3～4只小鼠。

免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價抗體為最終目的。免疫間隔一般2～3周。一般被免疫動物的血清抗體效價越高，融合后細胞產生高效價特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質量（如抗體的濃度和親和力）也與免疫過程中小鼠血清抗體的效價和親和力密切相關。末次免疫后3～4天，分離脾細胞融合。

　　骨髓瘤細胞及飼養細胞的制備

　　選擇瘤細胞株的最重要的一點是與待融合的B細胞同源。如待融合的是脾細胞，各種骨髓瘤細胞株均可應用，但應用最多的是Sp2/0細胞株。該細胞株生長及融合效率均佳，此外，該細胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細胞的最高生長刻度為9×105/ml，倍增時間通常為10～15h。融合細胞應選擇處于對數生長期、細胞形態和活性佳的細胞（活性應大于95％）。骨髓瘤細胞株在融合前應先用含8-氮鳥嘌呤的培養基作適應培養，在細胞融合的前一天用新鮮培養基調細胞濃度為2105/ml，次日一般即為對數生長期細胞。

　　在體外培養條件下，細胞的生長依賴適當的細胞密度，因而，在培養融合細胞或細胞克隆化培養時，還需加入其他飼養細胞（feedercell）。常用的飼養細胞為小鼠的腹腔細胞，制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細胞，其中在巨噬細胞和其他細胞。亦有用小鼠的脾細胞、大鼠或豚鼠的腹腔細胞作為飼養細胞的。

在制備飼養細胞時，切忌針頭刺破動物的消化器官，否則所獲細胞會有嚴重污染。飼養細胞調至1×105/ml，提前一天或當天置板孔中培養。

　　細胞融合

細胞融合是雜交瘤技術的中心環節，基本步驟是將兩種細胞混合后加入PEG使細胞彼此融合。其后吧培養液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細胞適當稀釋，分置培養板孔中培養。融合過程中有幾個問題應特別注意。①細胞比例：骨髓瘤細胞與脾細胞的比值可從1:2到1:10不等，常用1:4的比例。應保證兩種細胞在融合前都具有較高活性。②反應時間：在兩種細胞的混合細胞懸液中，第1min滴加4.5ml培養液；間隔2min滴加5ml培養液，爾后加培養液50ml。③培養液的成分：對融合細胞，良好的培養液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養成分均需嚴格配制。如融合效率降低，應隨時核查培養基情況。

　　有限稀釋法

篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細胞為HAT敏感細胞株，所以只有融合的細胞才能待續存活一周以上。融合細胞呈克隆生長，經有限稀釋后（一般稀釋至0.8個細胞/孔），按Poisson法計算，應有36％的孔為1個細胞/孔。細胞培養至覆蓋0％～20％孔底時，吸取培養上清用ELISA檢測抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，爾后進行抗原特異的ELISA測定，選高分泌特異性細胞株擴大培養或凍存。

　　單克隆抗體的制備和凍存

　　篩選出的陽性細胞株應及早進行抗體制備，因為融合細胞隨培養時間延長，發生污染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加�？贵w制備有兩種方法。一是增量培養法，即將雜交瘤細胞在體外培養，在培養液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設備，一般應用無血清培養基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達數毫克甚至數十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。接種細胞的數量應適當，一般為5×105/鼠，可根據腹水生長情況適當增減。

選出的陽性細胞株應及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存于液氮的細胞株活性僅有輕微的降低，而凍存在－70℃冰箱則活性改變較快。細胞不同于菌種，凍存過程中需格外小心。二甲亞砜（DMSO）是普遍應用的凍存保護劑。凍存細胞復蘇后的活性多在50％～95％之間。如果低于50％，則說明凍存復蘇過程有問題。

　　單克隆抗體的純化

　　單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化，腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高，純化效果好。按所要求的純度不同采用相應的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達到純化目的，也有采用較簡單的酸沉淀方法。目前最有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體（最常用Sepharose）交聯，制備親和層析柱將抗體結合后洗脫，回收率可達90％以上。蛋白可與IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3結合，同時還結合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外光吸收法粗測，小鼠IgG單克隆抗體溶液在A280nm時，1.44（吸光單位）相當于1mg/ml。經低pH洗脫后在收集管內預置中和液或速加中和液對保持純化抗體的活性至關重要。

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單克隆技術鏈接:

The production of monoclonal antibody by hybridoma fusion
Making Monoclonal Antibodies
Fusion and Cloning
Monoclonal Antibody Production
Monoclonal Antibody Screening by Direct ELISA
Tips and hints for the storage of antibodies
Cell Fusion
Protocol for Cell Fusion
General Fusion Protocol
Fusion of Mouse, Rat, or Hamster Cell
Immunization Protocol for Monoclonal Antibody Production
Cloning by Limiting Dilution of Hybridoma
Limiting Dilutions
Protein A Purification of Antibody
Protein G Purification of Antibodies
Purification of Antiserum or Ascites by Protein A/G Chromatography
Affinity Purification of Antibodies
Antibody Purification
Antibody Purification
Antibody Purification on Protein G Column
Antibody Purification Protocol
Column Purification of mAB
Coupling Antibodies to Protein A/G
Coupling Peptides to Resin for Affinity Purification
Purification of Anti Peptide Antibody
Purification of mAb (IgG)