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同位素原位雜交組化與免疫組化PAP法的聯(lián)合程序

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27
 。1)切片入PBS沖洗5min,最好是將切片漂洗于滅菌器皿中。
 。2)0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。
 。3)0.4%Triton X-100 PBS 15min。
 。4)1μg/ml蛋白酶K,37℃保溫30min。
 。5)4%多聚甲醛PBS固定5min 。
  (6)PBS沖洗2×3min。
  (7)0.25%乙酸酐(0.1mol/L 三乙醇胺配)10min。
 。8)2×SSC沖洗10min。
  (9)雜交:如是cDNA探針用前需進(jìn)行變性處理,載片法時(shí)將切片在空氣中晾干,加含探針的雜交液10μl于切片上,蓋上22×22mm的硅化蓋片或相當(dāng)大小看蠟?zāi)ぃ?H標(biāo)記探針每10μl雜交液含1×105cpm探針,32P或35S標(biāo)記探針每10μl雜交液含5×105cpm探針;如是漂浮切片,則用滅菌吸水紙將切片水份盡量吸干,然后入雜交液,探針濃度和載片法一樣。入雜交液后43℃保溫12~16h。
  (10)4×SSc 37℃沖洗10~30min。
 。11)2×SSC(如為RNA探針則含20μg/ml RNase)37℃沖洗30min。
 。12)1×SSC和0.1×SSc 37℃分別沖洗30min。
  (13)PBS沖洗2×5min。(轉(zhuǎn)錄ISHH)
 。14)0.5%H2O2 PBS室溫30min。
 。15)1%BSA 37℃,30min 。
  (16)第一抗體,4℃孵育16~24h。
  (17)PBS沖洗4×5min。
 。18)第二抗體37℃,1h。
 。19)PBS沖洗3×5min。
  (20)兔PAp 37℃,1h 。
  (21)PBS沖洗3×5min。
 。22)DAB顯色液5~10min(DAB顯色液:0.05贐 0.03% H2O2 PBS液配)。
  (23)PBS沖洗3×5min。如是漂浮切片則將其貼于涂有粘附劑的載片上,晾干。
  (24)切片入70%,85%,95%和2個(gè)100%酒精脫水,空氣干燥。
 。25)在暗室涂布乳膠(乳膠配制:乳膠原液:0.6mol/L醋酸胺=1:1),晾干,裝入自顯影暗盒。
 。26)4℃曝光:3H標(biāo)記探針4~8周,35S標(biāo)記探針1~4周,32P標(biāo)記探針7~10天。
  (27)D196顯影液,20℃顯影5~10min。
 。28)自來(lái)水沖洗數(shù)秒。
  (29)F5堅(jiān)膜定影液10min。
 。30)自來(lái)水沖洗15min。
  (31)切片溫箱烤干,脫水,透明,封片。
 
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