Ⅰ、反應(yīng)體系
A、 抗體
1、 第一抗體:常用的或自備的抗體
a、 如果第一抗體或自備的抗體能夠進(jìn)行熒光標(biāo)記(如FITC,PE或其他),請(qǐng)參考直接染色步驟
b、 如果第一抗體不能進(jìn)行熒光標(biāo)記,則參考間接染色步驟
2、 第二抗體:經(jīng)熒光標(biāo)記過的多克隆抗體
B、 緩沖體系:PBS(Ca2 and Mg2 free,e.g.,Cat.#9240,Irvine Scientific,Santa Ana,CA)+2%新鮮小牛血清(或者0.2%BSA)+0.1%疊氮鈉
C、 HAB(e.g.,Cat.#50009,Irvine Scientific,CA),其他途徑購買的經(jīng)熱失活的HAB或經(jīng)56℃失活1小時(shí)的HAB。將其分裝成小包裝并于-20℃貯藏。
Ⅱ、步驟
1、 將要檢測的樣品按常規(guī)的方法制成單細(xì)胞懸浮液。在最后的步驟中,用1ml預(yù)冷的緩沖液至少洗一次,再用預(yù)冷的緩沖液將細(xì)胞懸浮至濃度為1×107cells/ml(從而50μl=5×105cells)
檢測細(xì)胞活力是否達(dá)到90%。如果細(xì)胞活力低于90%,必須通過Ficoll-Hypaque分離法去除死細(xì)胞,否則死細(xì)胞會(huì)非特異地結(jié)合到抗體上的。更適宜的方法是將死細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀分析加以區(qū)分,以去除死細(xì)胞(具體請(qǐng)參考在通過流式細(xì)胞儀捕獲前在最后的重新懸浮細(xì)胞時(shí)加入propidium iodide或7-氨基-放線菌素D的方法)
2、 加入50μl的細(xì)胞懸浮液至離心管底部。
3、 在每一管中分別加入50μl的HAB,并充分混勻,于室溫中靜置1分鐘以上。
4、 然后加入適宜數(shù)量的單克隆抗體至離心管底部,置于冰上。
注意:進(jìn)行兩種或三種顏色染色時(shí),請(qǐng)同時(shí)將所有的已經(jīng)熒光標(biāo)記的抗體同時(shí)加入。
5、 輕輕振蕩后,于4℃下暗置30分鐘。
6、 用1ml的緩沖液洗兩次,然后置于4℃下以備通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行捕獲。
間接染色法
1-6、如前所述,用經(jīng)稀釋的未標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)細(xì)胞樣品處理;
7、 將細(xì)胞沉淀重新懸浮于50μl的HAB中,混勻,于室溫中靜置1分鐘以上;
8、 加入50μl經(jīng)熒光標(biāo)記的第二抗體稀釋液;
9、 輕輕振蕩后于4℃下暗置20分鐘;
10、 用1ml的緩沖液洗兩次,于250g下離心5分鐘;
11、 將樣品重新懸浮于1ml緩沖液中,于4℃下避光保存待用。
注意:此法并不適用于Ig表面染色或用抗體直接對(duì)FC受體進(jìn)行染色。