FCM以它的快速、靈活及定量的特點被廣泛地應用于免疫學的基礎研究和臨床應用的各個方面，尤其是結合單克隆抗體技術，在免疫分型、分選、腫瘤細胞的免疫監測、機體免疫狀態的監測、免疫細胞的系統發生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現代免疫技術的重要組成部分。基于免疫技術是免疫細胞化學分析技術的基礎，我們著重介紹FCM在免疫應用中的技術問題。
　　（1）免疫應用的激發光源和濾片系統：適用于免疫技術的FCM的激發光是氪離子氣體激光器，光譜中波長為531nm和856nm的譜線最強。為了擴大儀器對雙標記或三標記染色的熒光信號的分辨范圍可使用雙激光光源。

　　為了減少細胞由于激光束造成的散射光對光電倍增管的影響，要使用貼有干涉膜的濾片系統。為了同時測定兩種波長以上的熒光信號，光路中還要使用二向性分光元件。

　　為了測定伴隨細胞轉化過程所產生的早期免疫及生化性質的改變，例如膜的流行性，DNA構象變化等，可以使用偏振片。

　　總之，應用于免疫學時要充分考慮有關光源及光學濾片系統的正確使用。

　　（2）免疫應用的熒光染料及染色：免疫應用中的熒光染料主要有FITC（488nm）、TRITC（515nm）、PE（藻紅蛋白，575nm）及其組合。在進行多種標記時特別要注意結合抗體的每種色素都不干擾抗體反應的特異性，也不相互干擾。

　　免疫熒光染色有直接法和間接法二類：

　　①直接染色法

　　1）取約106的細胞置于尖底離心管內，管內液體要少些。加熒光標記抗體，在4℃溫度下靜置15～30min。若作雙標記染色也可直接加入。

　　2）用冷的10%的小牛血清、0.1%的疊氮鈉溶液，1/15mol/L的PBS（pH4.4）離心清洗細胞2次。1000rpm離心5min或4000rpm離心1min。

　　3）加入適量緩沖液待測。

　　②間接染色法：

　　1）取106細胞加特異的第一抗體，4℃溫度下靜置15～30min。

　　2）加緩沖液離心清洗2次后，吸盡殘留液體，彈散沉淀，加入熒光標記的第二抗體，4℃靜置30　min。

　　3）緩沖液離心清洗2次后加入適量緩沖液待測。為減少無關因素干擾，操作盡量在水浴中進行。

　　染色中應注意的事項：①細胞標本在整個過程中要盡量保持新鮮，采用有效措施防止表面抗原消失和細胞死亡；②熒光標記物用前應用濾膜或高速離心去除顆粒或沉渣以減少非特異性干擾；③細胞標本染色前應除死細胞；④為提高靈敏度可用三步間接染色法。

　　（3）免疫熒光標本的特殊處理：

　　①死細胞及碎片去除：樣品中不可避免地存在著死細胞及碎片，影響分析結果。對于血細胞可用FCM通過0。散射的差異不經染色而將死細胞分出棄除；對于培養細胞，由于其大小分布不均，可在樣品內加少量PI染色后將死細胞去掉。一般情況下即可用儀器直接去除碎片，也可用血清沉降法去除大碎片，用離法去除小碎片。

　　②標本的保存和固定：實驗中大多數樣品在染色或分析前需要保存一定的時間，有時甚至需要進行固定。

　　未染色的新鮮標本貯存方法如下：10%二甲基亞砜，90%小牛血清，5×106～1×107細胞在-70℃過夜，然后置液氮中可長期保存。

　　免疫染色未經固定的標本在4℃可保存48h。若需存放時間較長、或標本具有傳染性，應該用固定劑固定。常用的固定劑配方是：1%～4%的多聚甲醛和PBS或0.8%的生理鹽水配成p H7.2的固定液；或用0.37%～1.5%甲醛和PBS配成p H7.4的固定液。固定方法是：將經免疫熒光染色的細胞離心沉淀，再加入固定液混勻，放在4℃溫度保存。一般來說，經固定處理的標本保存1周至2個月，多數樣品的陽性細胞群體比例及熒光強度增色能保持在正常范圍之內。

　　（4）主要檢測的免疫指標：

　　①細胞毒試驗：細胞毒是機體的一種免疫監督機制，細胞毒實驗是一項重要的免疫指標。例如天然殺傷細胞NK（Natural killer）是一種引起免疫媒介的效應物，在抗腫瘤及感染因子的免疫監督系統中起著重要作用。研究表明，對NK細胞的測量可以做為免疫治療監測的重要參數和有效的預后征狀的指標。所使用的熒光探針為CFDA（Caboxy-fluorescein diacetate）。

　　②吞噬功能實驗：單核吞噬細胞系統是機體的主要防御系統之一。FCM可以快速、定量地檢查吞噬細胞的吞噬能力和速度。

　　③I型變變態反應的IgE受體細胞、IgE結合因子的檢查。

　　④胞漿Ig及血清Ig分析，血小板表面的IgG測定，等等。