（一）材料與試劑
1．精制瓊脂粉
2．打孔器、加樣器、平皿
3．標準陽性血清和標準陰性血清，由指定的生物制品廠購買。
4．馬傳染性貧血病瓊脂擴散用抗原，由指定的生物制品廠購買。
5．pH7.4PBS液
（二）操作方法
1．取瓊脂粉1g，加含有1/萬硫柳汞的PBS液100ml，水浴加熱使之完全融化。
2．取平皿（直徑9cm），將融化的瓊脂倒入，每個平皿倒入15ml～18ml，使其厚度約
為2.5mm，冷卻后加蓋，放入4℃～8℃冰箱內，至少4h。
3．按7孔梅花圖案打孔，中央孔一個，孔徑4mm，外周孔6個，直徑6mm，孔距8mm
（中間孔至外周孔的中心距離），封底。
4．中央孔加抗原，2、5號孔加標準陽性血清，其余1、3、4、6孔分別加被檢血清，加滿為止。加畢后，平皿加蓋，平放入鋪有數層濕紗布的帶蓋搪瓷盤內，置15℃～30℃條件下孵育。每日觀察一次，連續3天。
（三）結果判定
當標準陽性血清孔與抗原之間出現一條明顯致密的沉淀線時，再進行被檢血清孔的判定。
陽性：被檢血清孔與抗原孔之間形成一條沉淀線，或者標準陽性血清的沉淀線末端向內彎向毗鄰的被檢血清孔。
陰性：被檢血清孔與抗原孔之間無沉淀線，且標準血清陽性孔與抗原孔之間的沉淀線直向毗鄰的被檢血清孔。
可疑：標準陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線末端似乎彎向毗鄰被檢血清孔，但不易判斷。此種結果判為可疑。可疑結果必須進行復試，將抗原做2×，4×，6×，8×等倍數稀釋，進行瓊脂擴散，觀察時間可延長至5d，最后判定結果。