（一）材料與試劑
1．瓊脂粉
2．平皿
3．打孔器
4．生理鹽水或其他緩沖液，可加1/萬的硫柳汞或疊氮鈉防腐。
（二）操作方法
1．稱取一定量的瓊脂粉，按1%左右（0.8％～1.5%）的比例加入生理鹽水或緩沖液，水浴煮沸融化20min。
2．將融化的瓊脂倒入平皿內，使厚度2mm～3mm。自然冷卻。
3．根據(jù)要求（孔徑即孔的直徑，孔距即兩孔圓心之間的距離，包括兩孔的半徑）按模板打孔。也可直接用組合打孔器打孔。現(xiàn)在一般多打成梅花形孔圖。
4．挑出孔內瓊脂，注意不要挑破孔緣。
5．在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，以封底，以免加樣后液體從孔底滲漏。
6．以毛細滴管吸取樣品加入孔內，注意不要產生氣泡，以加滿為度。加少了，影響反應程度，加多了，易溢出，也影響反應結果。
7．加畢后，蓋上平皿蓋，將平皿翻過來，置濕盤中，37℃自由擴散24h～48h。
（三）結果判定
1．用以檢測抗原或比較抗原差異時，將抗血清置中心孔，將待測抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰孔。若出現(xiàn)沉淀帶完全融合，證明為同種抗原；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇；若二條沉淀線相互交叉，說明二者抗原完全不同，見下圖。
圖3-1 瓊脂免疫擴散試驗結果示意圖
中間孔含A,B,C三種抗血清，a、b和a、c為不同型的抗原（呈雙線或交叉），b、c為同一血清型的不同亞型（部分融合，有交叉）
2．用做血清流行病學調查時，將標準抗原置中心孔，周圍1、3、5孔加標準陽性血清，2、4、6孔分別加待檢血清。待檢孔與陽性孔出現(xiàn)的沉淀帶完全融合者判為陽性。待檢血清無沉淀帶或所出現(xiàn)的沉淀帶與陽性對照的沉淀帶完全交叉者判為陰性。待檢孔雖未出現(xiàn)沉淀帶，但兩陽性孔的沉淀帶在接近待檢孔時，兩端均內向有所彎曲者判弱陽性。若僅一端有所彎曲，另一端仍為直線者，判為可疑，需重檢。重檢時，可加大檢樣的量。
檢樣孔無沉淀帶，但兩側陽性孔的沉淀帶在接近檢樣孔時變得模糊、消失，可能為待檢血清中抗體濃度過大，致使沉淀帶溶解，可將樣品稀釋后重檢。
3．用以檢測的抗血清的效價時，將抗原置中心孔，抗血清倍比稀釋后置周圍孔，以出現(xiàn)沉淀帶的血清最高稀釋倍數(shù)為該抗血清的瓊擴效價。
（四）注意事項
1．不規(guī)則的沉淀線可能是加樣過滿溢出、孔型不規(guī)則、邊緣開裂、孔底滲漏、孵育時沒放水平、擴散時瓊脂變干燥、溫度過高蛋白質變性或未加防腐劑導致細菌污染等所致。
2．抗原抗體的比例與沉淀帶的位置、清晰度有關。如抗原過多，沉淀帶向抗體孔偏移和增厚，反之亦然。可用不同稀釋度的反應液試驗后調節(jié)。