若想得到理想的ICC染色結果、正確地判斷抗原物質在組織細胞內的位置，除需有良好酶和抗體外，保持組織細胞內抗原物質的不動性（Immobility）和免疫活性也是至關重要的。換言之，如果抗原物質在組織細胞間彌散、丟失或失去免疫活性，無論如何努力染色都是徒勞的，所以說固定是ICC染色中非常重要的一環。ICC與其它組織學技術不同，除要求保存良好的結構外，還需保存組織抗原的免疫活性。一般認為，新鮮組織能夠最大限度地保存組織抗原的免疫活性，但結構較差，易出現抗原彌散丟失現象。Cumming（1980）報告，不固定的組織切片ICC染色時，環鳥苷酸含量丟失80%以上。固定的目的是使構成組織細胞成分的蛋白等物質不溶于水和有機溶劑，并迅速使組織細胞中各種酶降解、失活，防止組織自溶和抗原彌散，保持組織細胞的完整性和所要檢測物質的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的關鍵一步。用于ICC的固定劑種類較多，選擇時應根據所要檢測物質的抗原性質和切片方法以及所用抗體特征等做最佳篩選。制片及固定方法見第一章　，下面介紹兩種近年報道的新方法。

　　1．AMEX（Acetone Meth Enzoate Xylene ）法　　是改良的冰凍置換法（freeze substitution）的簡稱，主要用于石蠟包埋標本。Sato(1986)報告，該法具有同新鮮（未固定）組織冰凍切片同樣的抗原保持性和石蠟切片的良好組織結構保存。其機制為：組織在丙酮中固定（脫水），組織細胞內水份逐漸被丙酮取代，繼之，用苯甲酸酯取代組織內丙酮，經二甲苯置換后，石蠟包埋。組織在-20℃丙酮內過夜亦形成冰晶，所以原方法將組織先置4℃丙酮20～30min，再移入-20℃丙酮過夜。實際上組織在4℃丙酮內過夜亦可得到同樣效果。如在該固定液內加入少量蛋白酶活性阻斷劑，并采用低溶點石蠟包埋等，可獲得更佳染色結果。

　　2．微波固定（Microwave fixation）　　為近幾年所注目的問題之一。該方法能保持良好的組織結構和抗原性，適于各種切片的酶組化、ICC以及免疫電鏡等材料固定。其固定機理可能與微波（頻率1000～3000MHz）具有被水分吸收的性質（通常所用的微波是頻率2450MHz，波長12cm）；生物材料含有大量水份，照射后，溫度升高，分子運動加快，促進固定液向組織內滲透，加速與組織成分的反應，短時間內達到固定的效果等有關。經微波照射固定的組織，需置相同固定液中，繼續固定2～6h，室溫。

　　近年研究的專門固定用的微波爐已商品化，例如：Bio-Rad H2500型、日新EM·MWE-2等，該類微波爐能夠準確地調節　照射時間和測定被照材料的瞬時溫度。利用家庭微波爐代替時，應選用能以秒為單位調控的微波爐。實驗材料不同，所需固定液的量、照射時間等各異，所以應在預實驗的基礎上，找出合適的固定液量、照射時間和溫度。多數實驗室的條件為：固定液5～10ml，照射10～30s，照射后固定液的溫度≤50。C。其方法為：將實驗標本置于微波爐旋轉臺的中央，周邊放一燒杯盛300～500ml純水，吸收照射時爐內產生的熱量，選擇強擋照射10～30s 。接通電源（on）至微波產生利用超聲波代替微波照射，或二者并用，照射后，組織標本和固定液的溫度升高較少，亦能獲得短時間內良好的固定效果（Yasuda 1992）。

　　二、切片

　　光鏡ICC染色，常用的有冰凍切片和石蠟切片兩種，二者各有其優缺點，應根據抗原的性質、實驗室條件，合理選擇之。對未知抗原顯示時，最好同時應用。冰凍切片為ICC研究所首選。

　　Shi（1991）等報告：微波爐照射的切片，能夠激活部分核內抗原活性。其機制不清，可能與高溫、高熱的作用，使核內DNA雙鏈解開，DNA、RNA解離，抗原暴露有關。其步驟為：將切片脫蠟水洗后，置染色瓶中，加入去離子水或緩沖液至瓶頸處，反復多次照射，每次1min，照射5～10次，每次照射后，補充瓶中蒸發掉的液體，照射溫度不超過90～95℃為宜。此處理后，細胞核染色以蘇木精為佳