經過抗體測定的陽性孔，可以擴大培養，進行克隆，以得到單個細胞的后代分泌單克隆抗體。克隆的時間一般說來越早越好。因為在這個時期各種雜交瘤細胞同時旺盛生長，互相爭奪營養和空間，而產生指定抗體的細胞有被淹沒和淘汰的可能。但克隆時間也不宜太早，太早細胞性狀不穩定，數量少也易丟失。
克隆化的陽性雜交瘤細胞，經過一段時期培養之后，也還會因為細胞突變或特定染色體的丟失，使部分細胞喪失產生抗體的能力，所以需要再次或多次克隆化培養。克隆化次數的多少由分泌能力強弱和抗原的免疫性強弱而決定。一般說，免疫性強的抗原克隆次數可少一些，但至少要3～5次克隆才能穩定。
克隆化的方法很多，包括有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法及熒光激活分離法等。
（1）有限稀釋法
1．材料
（1）微量培養盤，盤內各孔于克隆化前一天培養小鼠腹腔細胞（即飼養細胞）每孔2萬～4萬。
（2）HT培養基
2．操作方法
（1）取出抗體陽性孔細胞，用HT培養液制成細胞懸液。并取樣進行臺盼蘭染色，計數。
（2）用HT培養液將細胞稀釋成200個/ml、40個/ml、20個/ml和的懸液。
（3）用吸管將細胞懸液分別種入微量培養盤，每孔0.05ml，細胞含量分別為10個/孔、2個/孔、1個/孔和0.5個/孔。
（4）5％CO2飽和濕度，37℃培養。
（5）每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長情況，選擇只有一個集落生長的孔，棄掉兩個以上和沒有細胞生長的孔。
（6）克隆大量繁殖后，布滿孔底的1/3～1/2時，測培養液抗體。
（7）抗體陽性孔細胞，移到有飼養層的組織培養瓶中，并傳2～4代就可以脫離飼養細胞，建成克隆株。
（2）軟瓊脂克隆化
借助撒在軟瓊脂上單個細胞定位生長，而達到克隆化，具體操作如下：
1．配2.5％的瓊脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。
2．將117ml完全DMEM液和3ml 10倍濃度的DMEM液混合，置45℃水浴預熱。
3．將瓊脂糖與DMEM液混合，即為含0.5％瓊脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾細胞。
4．每塊平皿加10ml，于室溫中凝固。
5．DMEM中的細胞與DMEM—瓊脂1:1混合，將細胞瓊脂混合物2ml鋪于凝固的平板上，使其全部覆蓋。
6．放入CO2箱飽和濕度，37℃培養10天。
7．用PBS配制0.6％瓊脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保溫情況下取一試管，迅速加入0.1ml 25％羊紅血球，0.2ml豚鼠補體，2.7ml 0.6％瓊脂糖。
8．用3ml瓊脂糖—羊紅血球混合液覆蓋克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。從克隆上部溶解羊紅血球的溶血范圍，可篩選抗羊紅血球Ig。
（3）顯微鏡操作法
在直徑6cm培養皿中，加入1ml 1.0×108細胞懸液放置5％CO2飽和濕度，37℃溫箱中放置30min以上，倒置顯微鏡下，尋找那些與周圍相距甚遠的單個細胞，將毛細管口（一頭有直角彎頭毛細管，一頭連接一尺長乳膠管，用口控制液體進入）水平置放于液面上，左右微動，直到看見管口，對準細胞，吸入毛細管，將管中細胞移到預先加有2.0×104~5.0×104飼養細胞96孔板內，培養后，即可獲得單個細胞形成的克隆。
（4）熒光激活分離法
用一種熒光激活細胞分類器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS）。其基本原理是：將細胞經熒光抗體染色后，經噴嘴形成單個細胞的線形液滴，在萊塞光激發下，熒光素發射熒光，此信號由光電倍增管接收，再結合細胞形態大小產生光散射信號，經電腦處理，產生信號并與預定的信號對比，根據細胞熒光強度及細胞大小不同，將細胞分成不同級別，在電場中發生偏離，而分別收集于不同容器中。