間接紅血球凝集反應（簡稱間接血凝）是間接凝集反應中應用最廣的一種方法。

原理

以紅血球為載體的間接凝集反應叫做間接血凝。將抗原吸附在紅血球上用以檢測微量抗體稱為正向間接血凝，以抗體吸附于紅血球上，檢測相應的抗原，稱為反向間接血凝。

用抗原吸附紅血球，一般比較容易，但用免疫血清吸附紅血球，則困難得多，而且往往不易獲得良好的結果，因為免疫血清中的成分非常復雜。許多其他蛋白質和非抗體活性的免疫球蛋白占據紅血球的表面，而影響血球的特異性凝集。

材料與試劑

1．紅血球

2．反應板 分聚苯乙烯塑料板和有機玻璃板（聚甲基丙烯酸甲酯），每板又有96孔和72孔兩種規格。按孔型又可分為V和U型兩種，V型具有更典型的凝集模型，U型有時比V型的血清效價高1～2孔。反應板不能煮沸消毒和浸泡于來蘇兒水中。消毒可用0.5％甲醛溶液，1％新潔爾滅及紫外線照射等。

3．稀釋棒 由合金制成。棒頭有8條溝，吸液量為0.025ml，通過火焰，使表面氧化變粗易于吸取液體。它的作用是蘸取、轉移、混合液體。為了長期保持棒頭的氧化層，每使用20次左右，應過火焰一次。

4．標準滴管 每滴0.025ml。

5．微型振蕩器

6．兔血清鹽水 作為穩定劑，用于懸浮致敏紅血球以及稀釋供試血清。制法為：無菌采取兔血，收集血清，滅活后4℃保存。同時，取所需量加4倍量的2.5％血球懸液，混勻，37℃水浴10min，以吸附異嗜性凝集素，離心后取上清；再以pH7.2PBS稀釋成1％兔血清鹽水，冰箱保存可供數日內之用。

7．抗原 盡可能使用高純度的抗原。

8．供試血清或其它含抗體材料 供試血清必須滅活，加9倍2.5％的紅血球懸液，37℃水浴10min～20min，進行吸收，然后離心，取上清，即為1:10的血清稀釋液。

9．醛化劑 甲醛、戊二醛、丙酮醛等。

10．優質鞣酸

11．0.15Mol/L pH6.4PBS液，用于紅血球致敏。

12．0.15Mol/L pH7.2PBS液，用于一般稀釋液。

13．0.02％牛血清白蛋白PBS液

14．生理鹽水

紅血球的處理

1．新鮮紅血球 新鮮紅血球用阿氏液保存于4℃，可供3周內使用。采用新鮮紅血球做凝集反應，模型新鮮，典型，而且敏感性也比醛化紅血球高出1～2個滴度。但用新鮮紅血球致敏后，保存時間短，而且不同動物個體和不同批次來源的紅血球均有差異，影響試驗結果和分析。為了克服這一缺點，目前多采用醛化紅血球或鞣化紅血球。

2．紅血球醛化極其優點

（1）醛化方法：常見的醛化劑有甲醛、戊二醛和丙酮醛。

甲醛醛化過程：①將紅血球用pH7.2PBS反復洗滌4次，以除去血清蛋白以及紅血球表面的膠體物質；②按1︰8的比例取紅血球（壓積）和3％甲醛液（用pH7.2PBS稀釋，預先冷卻至4℃），緩慢混合，加膠塞4℃作用24h，不時搖動；③傾去上清液，再以1︰2（V／V）加入36％～38％冷的（10℃）甲醛溶液，混勻，再放入4℃24h；④⑷離心去上清，以生理鹽水反復洗滌4次。徹底清除甲醛液，最后以生理鹽水配成10％懸液甲醛化紅血球，加1／萬硫柳汞防腐，4℃保存。

戊二醛醛化過程：①取新鮮紅血球，以生理鹽水洗滌4次；②以0.15Mol/L pH 7.2 PBS配成1％戊二醛溶液，4℃保存備用；③將100ml 1％冰冷的戊二醛液加入到10ml～15ml紅血球中，邊加邊攪拌（也可置電磁攪拌器上）30min；④離心去上清，以生理鹽水洗滌4次，最后以PBS液（或生理鹽水）配成10％懸液，加1／萬硫柳汞，4℃保存。

丙酮醛—甲醛雙醛化過程：①取新鮮紅血球，洗滌4次，配成8％的懸液；②于紅血球懸液中加等量的3％丙酮醛室溫電磁攪拌16h～18h；③洗滌5次，再配成8％的懸液；④于紅血球懸液中加等量的3％甲醛，電磁攪拌16h～18h；⑤洗滌5次，最后以pH 7.2 PBS配成10％的懸液，加1／萬硫柳汞防腐，4℃保存。

（3）醛化紅血球的優點：①性質穩定，不影響紅血球表面的吸附能力；②重復性好，易標準化。③可較長期保存，醛化后4℃保存，有效期可至1年，如凍干保存，有效期則更長。

（4）影響醛化的因素：①紅血球的潔凈程度：由于紅血球表面殘留血漿蛋白和其它膠質，易引起自家凝集，所以一定要充分洗凈；②紅血球的濃度：醛化時應盡量使紅血球稀釋度低一些，以減少紅血球的凝集和變形；③醛化時的溫度與醛化紅血球的質量有很大關系，一般認為最好是37℃。但有人認為應于4℃進行醛化；④醛化劑的濃度和醛化次數：醛化劑的濃度過大，易引起紅血球皺褶，濃度過低，又會增加溶血機會，所以一般以3％醛化濃度為宜。家禽紅血球一般醛化1～2次即可，而哺乳動物紅血球醛化2次比醛化1次要好，敏感性高，保存時間也長。不同的雙醛化，其抗原致敏作用有所不同。

表 各種雙醛化紅細胞的結果比較

脈沖／min是¹³¹I標記的特異性抗體結合到細胞上的指標，脈沖數越大，結合抗體量也越多。但是從表5－1中可以看出結合量同可測出的抗原滴度是不平行的。

適當的振蕩可使醛化劑與紅血球充分接觸，并可排除凝塊形成。但過分地振蕩，則易產生氣泡，引起紅血球變形。

3．紅血球鞣化 多糖、脂多糖、類脂等一些半抗原易于吸附紅血球表面，所以一般醛化處理即可。但對于許多蛋白質抗原，由于不易吸附于紅血球表面，所以在醛化的基礎上，必須再以一定濃度的鞣酸進行處理，強化它對蛋白質的吸附能力。

有人認為雙醛化后可不必進行鞣化。首都醫院做了“丙酮醛＋甲醛＋鞣化”和不加鞣化得出相同的抗原滴度。但多數意見認為醛化后仍需鞣化比較好。

(1) 鞣化過程：①將10％醛化紅血球用生理鹽水洗滌2次，再以0.15Mol/L pH7.2PBS洗滌1次，最后以PBS配成2.50％懸液；②稱取優質鞣酸20mg，以生理鹽水4ml配成1﹕200的濃度，于37℃水浴，使之充分溶解，然后再以pH7.2PBS稀釋成1﹕2 000的濃度。當天配制、當天用完；③1份2.5％紅血球懸液與1份1﹕2 000鞣酸液充分混合，37℃水浴10min，1 500r／min離心，去上清，用PBS液洗滌1次；④以0.02％牛血清白蛋白PBS液洗滌1次，最后以牛血清白蛋白PBS配成2.5％鞣化紅血球。

（2）影響鞣化的因素：①鞣酸的質量：這是很重要的，所以必須采用優質鞣酸。分析純的鞣酸呈面包屑狀，不呈面粉狀，有折光性；②鞣酸的濃度：濃度過高，可以出現紅血球的凝集現象；濃度過低，達不到紅血球的活化作用。醛化過的紅血球所采用的鞣酸濃度一般比新鮮紅血球高10倍。通常以1：2 000為佳；③鞣化時間：鞣化過程一般10min～15min即可完成。時間再長也不能吸附更多的抗原，提高血凝滴度。鞣化時采用的pH對吸附抗原和血凝滴度影響不大，一般采用pH7.2的PBS液。

紅血球的致敏

1．致敏抗原劑量的確定 一般而言，在一定的范圍內，抗原的濃度與試驗的敏感性呈正比，超過這個范圍，再增加抗原，敏感性不會再提高，而且過大，有時會引起非特異性凝集。當采用一種新的抗原時，必須經過試驗，選擇適當的抗原致敏濃度，即把抗原稀釋成幾個不同的濃度分別致敏紅血球。再用這些致敏紅血球分別與標準陽性血清進行試驗，與標準陽性血清呈最高滴度的陽性反應的最小抗原劑量，即為該抗原的單位計量。致敏時，根據不同的抗原，可采用2～4個單位計量進行致敏。

2．致敏方法 各種抗原的致敏方法大致相同，一般蛋白質的致敏方法如下：

所需濃度的抗原 1 份

pH6.4PBS液 4 份

2.50％的鞣化紅血球懸液 1 份

混勻，置37℃水浴30min，離心，沉淀后，以2.5％兔血清生理鹽水洗滌1次，懸浮于1份兔血清生理鹽水中。

3．影響紅血球致敏的因素
⑴要有高純度或高效價的抗原或抗體。

⑵被致敏抗原或抗體的適當劑量和濃度。如抗體一般以μg/ml IgG為宜。抗豬瘟IgG一般用80μg/ml～160μg/ml，抗口蹄疫IgG 20μg/ml~40μg/ml，抗豬水泡病IgG 130μg/ml~160μg/ml，抗豬肺疫IgG 30μg/ml ~40μg/ml，抗豬弓形體20μg/ml~40μg/ml，抗原一般用0.2mg/ml～1mg/ml。

⑶pH：除雞卵蛋白采用4.6～5.1外，其它通常采用5.6～6.4，高于7.2或低于4.6均可使紅血球發生自凝。

⑷致敏溫度：一般為37℃，范圍是20℃～40℃。

⑸致敏時間：一般采用30min為最適時間，具有良好的特異性和重復性。也有采用60min。時間過長，會造成紅血球的形態不整，反應結果紊亂等。

⑹血球濃度：一般為1％，范圍為0.5％～1.5％。

操作方法

可采用試管法、凹窩板法和微量法。前者稀釋度準確、結果清晰、終點明確。后者具有節約材料、操作方便、結果出現迅速等優點。

試管法的供試材料用兔血清鹽水二倍遞減稀釋，每管0.50ml，各管加致敏血球0.05ml，充分振蕩，混勻后置室溫，紅血球完全沉下（需數小時）或過夜后判定結果。

每次試驗需做下列對照：①血清對照：最高濃度的血清＋鞣酸血球；②鞣酸血球對照：兔血清鹽水＋鞣酸血球；③致敏血球對照：兔血清鹽水＋致敏血球；④標準陽性血清對照：稀釋已知滴度的陽性血清，加致敏血球以檢驗試驗的敏感性是否前后一致。

結果判定

＋＋＋＋：管底呈細密的顆粒凝集，邊緣不整齊。

＋＋＋ ：全管底呈光滑的均勻片層，邊緣折疊。

＋＋ ：全管底呈光滑的均勻片層，如傘狀。

＋ ：管底大部分復以光滑片層，邊緣稍厚。

± ：較“＋”面積更小，中央有沉積的紅血球。

— ：紅血球沉積在管底中央，如小圓盤或鈕扣狀。

以“＋＋”為滴度終點。