1．標(biāo)記酶的選擇條件
⑴ 活性高，分解底物的能力強(qiáng)。
⑵ 特異性強(qiáng)，即作用于底物的專一性強(qiáng)。
⑶ 與抗原抗體結(jié)合后仍保持酶的活性。
⑷ 與底物作用可以顯色。
⑸ 純度高、易純化，即含雜蛋白少。
⑹ 可溶性(水溶性)好，在溶液中穩(wěn)定。
⑺ 測定方法簡單。
⑻ 酶來源方便、價格低廉。
2．符合條件的酶
⑴ 辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)，分子量40 000。
⑵ 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase AKP），分子量82 000。
⑶ β-半乳糖甙酶（β-galactosidase），分子量540 000。
⑷ 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）,分子量186 000。
其中以HRP最為常用，因其具有活力高、穩(wěn)定、分子量小、易提純等優(yōu)點(diǎn)。
3．辣根過氧化物酶 HRP廣泛地分布于植物界，以辣根中含量最高。它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉輔基組成的一種糖蛋白，含糖量18%，它由300個氨基酸和4個二硫鍵連接而成。分子量40 000，等電點(diǎn)5.5～9.0之間，它催化的最適pH因供氫體不同而有所差異，但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。
HRP酶蛋白和其它雜蛋白的最大吸收光譜為275nm，輔基部分的最大吸收光譜為403nm，二者比值OD403/OD275為酶的純度。以RZ值(Reinheit Zabl德文)表示。RZ＞3為高質(zhì)量，RZ＞2.5為中等質(zhì)量，RZ＜2.5則需要純化。RZ值越小，表示雜蛋白越多,如RZ為0.6，則表示有75%的雜蛋白。
衡量酶質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)有兩條，一個是純度即RZ值，一個是活力。只用酶的純度表示是不全面的。目前國際上規(guī)定,酶的活力以國際單位表示。一個酶單位是在一定的條件下(pH、溫度和底物濃度)一分鐘能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的單位數(shù)稱為比活性。用比活性進(jìn)行酶的比較。
用作標(biāo)記的過氧化物酶活性一般要大于250units/mg。
4．HRP的作用底物與供氫體 底物為H2O2，催化時需供氫體。
⑴ 組化法常用的供氫體是3，3′－二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(3.3－diamino－benzidine . DAB)。其反應(yīng)物由于形成的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用于光學(xué)顯微鏡觀察。這種多聚物能還原和螯合四氧化鋨(OSO4)形成具有電子密度的產(chǎn)物，可適用于電子顯微鏡觀察。
⑵ 用于ELISA的供氫體有下列數(shù)種。
表 ELISA的供氫體
|
供 氫 體 |
反應(yīng)顏色 |
波長 |
終止劑 |
終止 顏色 |
測定波長 |
|
聯(lián)大茴香胺(OD) |
桔紅 |
512 |
5Mol/L HCI |
黃 |
400 |
|
鄰苯二胺(OPD) |
黃 |
444 |
2Mol/L H2SO4 |
桔黃 |
492 |
|
鄰苯甲苯胺(OT) |
蘭 |
636 |
2Mol/L H2SO4 |
黃 |
442 |
|
5－氨基水楊酸 |
褐 |
475 |
1Mol/L NaOH |
褐 |
449 |
以OD和OPD最為常用。OPD有致癌作用，使用時需注意。
5．堿性磷酸酶 可從小牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。它是一種磷酸脂酶,其作用是催化磷酸－脂水解釋放出無機(jī)磷酸而顯色。或者通過水解產(chǎn)生的磷酸與鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸，然后在還原劑作用下生成藍(lán)色的產(chǎn)物進(jìn)行測定。