一、引言
基因治療是指改變細胞遺傳物質為基礎的醫學治療。目前僅限于體細胞。

基因治療的技術和方式日趨多樣性。按基因導入的形式，分為體外基因導入（exvivo）及體內基因導入（invivo）兩種形式。前者是在體外將基因導入人細胞，然后將該細胞注入人體。其制品形式是外源基因轉化的細胞，適合在具有專門技術人才和GMP條件的醫療單位進行。后者則是將基因通過適當的導入系統直接導入人體，包括病毒的與非病毒的方法。其制品形式是基因工程技術改造的病毒或者是重組DNA、或者是DNA復（混）合物。基因治療制劑種類較多，因此，本指導原則不可能用一個模式來概括，只能提出一個共同的原則，具體的方案應根據這些原則，確定研究技術路線。其基本原則：一是必須確保安全與有效，要充分估計可能遇到的風險，并提出相應的質控要求；二是要促進基因治療的研究，并加強創新。對一些新的治療技術路線的相應質控要求，可有一定的靈活性，應注意到基因治療本身的特點以及它與經典的化學合成藥物或基因工程藥物的差別。目前，一些基因治療研究相對比較成熟，而一些則不夠完善，更加要求研究者在使用該技術指導原則時不可生搬硬套。為此，研究者應加強咨詢和論證，提出一個科學可行的研究方案，最終獲得確保安全有效的基因治療制品。

在向國家藥品監督管理局申報臨床試驗時，除須按本指導原則中"研究內容和制品質量控制"準備材料外，同時需提供下述材料：
（1）國內外研究現狀和進展（綜述）。包括：
1．所用基因的研究現狀和進展；
2．所用載體的研究現狀和進展；
3．所用基因導入系統和方法的研究現狀和進展；
4．該研究或制品相關的體外有效性實驗資料；
5．該研究或制品相關的動物試驗安全性和有效性資料；
6．該研究或制品相關的臨床試驗安全性和有效性資料；
7．該研究或制品的生產工藝現狀；
8．該研究或制品的質量控制現狀；
9．本研究或制品的先進性和創新點；
10．本研究或制品產業化的可行性。綜述內容須科學客觀。

（二）本研究或制品的知識產權情況。包括：1）本研究或制品的知識產權情況闡述；2）本研究或制品的知識產權檢索報告和檢索結果。知識產權情況的闡述和檢索應包括所用基因、載體、重組體、終產品的其它成分、生產用細胞和生產工藝等。

二、研究內容和制品質量控制
（一）DNA重組體或基因導入系統的構建
1．治療用的目的基因
詳細說明基因治療所用的目的基因及其來源（尤其是有否涉及國內外專利問題，應有專利查詢資料），獲得目的基因的材料方法和基因鑒定結果。

2．載體
包括載體DNA的限制性內切酶圖譜或基因庫資料。若有特殊的元件，如啟動子、增強子及PolyA位點等，應提供詳細資料。若有改變結構（如丟失片段，點突變或插入片段），須提供DNA測序結果。若屬新的或改變結構的病毒載體，須提供組建的材料、方法、組建步驟及鑒定結果的全部資料。

非病毒型基因導入系統，均需一個能在人體細胞表達目的基因的質粒。除裸露DNA外，還須附加其它的組分進行加工，如脂質體、多肽、金屬顆粒等。本指導原則不包括寡聚核苷酸（如AntisenseRNA,Ribozyme,RNAi等）類基因治療制品。

3．DNA重組體
詳細說明克隆步驟，材料方法；DNA序列分析圖譜和結果，注明啟動子、增強子、插入順序、目的基因及polyA順序等；重組體的限制性酶切圖譜和鑒定結果；重組體中基因表達水平和時程。

4．基因導入系統構建包括病毒載體與非病毒載體基因導入系統。
（1）病毒載體基因導入系統包括腺病毒載體、逆轉錄病毒載體和腺相關病毒載體基因導入系統等。需詳細描述形成單克隆原始病毒顆粒的方法、材料、技術路線和全部的鑒定方法、標準和結果。這些鑒定一般包括：結構鑒定（限制性酶切圖譜和PCR分析）、整個病毒的序列分析（≤40kb），基因體外表達和生物活性，SDS-PAGE、表達盒DNA序列分析、Westernblot分析、轉染效率、透射電鏡負染法觀察、復制型病毒的檢測和其它污染因子的檢測。

（2）非病毒基因導入系統除裸DNA外，一般包括兩個部分：一是哺乳動物細胞表達載體；二是其它載體物質，如脂質體、多肽或金屬粒子等。為此，需說明目的基因導入系統的性質與內容。由于部分病人對青霉素的過敏反應，最好不用耐氨芐青霉素基因作耐藥基因，而建議用卡那霉素或新霉素基因作耐藥基因。若用物理方法導入，須提供其詳細方法、步驟，基因導入效率及其表達的生物活性以及導入細胞后基因的穩定性，無重排或突變的證據。每一操作步驟必須鑒定其結果，通常的鑒定內容和方法有：限制性酶切圖譜，基因的PCR擴增，表達盒DNA序列分析，SDS-PAGE，Westernblot分析等。

（二）細胞庫及工程菌庫的建立和檢定
包括包裝和繁殖重組病毒的細胞庫和擴增重組質粒的工程菌庫。必須建立三級庫，即原始細胞庫（PrimarySeedBank）、種子細胞庫（MasterCellBank）和工作細胞庫（WorkingCellbank）；或原始工程菌庫、種子工程菌庫和工作工程菌庫。
1．細胞庫
（1）原始細胞庫
需說明來源、代數、細胞特性及有關檔案資料。對主細胞庫和工作細胞庫需詳細說明建庫過程，包括材料、方法、步驟、細胞庫存的數量和登記檔案等。

（2）主細胞庫
主細胞庫由原始細胞庫直接傳代建立或通過亞克隆方法篩選后建立。應明確使用代次。

（3）工作細胞庫
工作細胞庫由主細胞庫傳代建立。應明確工作細胞庫的使用代次。

（4）細胞庫檢定
①主細胞庫或工作細胞庫檢定應依據《生物制品生產用細胞的制備及檢定規程》的要求進行。
②病毒轉導效率和病毒的產量等的檢定
③導入基因的存在狀態，穩定性及其表達水平的檢測
④復制型病毒的檢測
若需用其它輔助病毒，須說明其來源、分離的方法步驟和傳代次數等。

2．工程菌庫
工程菌主種子庫和工作種子庫的建立和檢測應按現行《中國藥典》相關要求建立。
（1）工程菌主種子庫的檢定
①菌種同一性鑒定：菌種/株的來源、基因型及表型。基因型通
過RAPD方法鑒定，通過測定重組質粒的特殊標記和抗藥性標記確定表型。
②菌種培養純度檢定：外源因子（如雜菌、真菌、噬菌體等）的檢測。
③菌種穩定性檢定：轉化菌的比例，擴增條件、質粒拷貝數，基因表達量、允許的傳代次數。
④基因表達盒序列分析：插入的目的片段以及調控序列進行測序分析。

（2）工程菌工作種子庫的檢定
除外基因表達盒序列分析，其它檢定內容按上述工程菌主種子細胞庫的檢定。

（三）基因治療制品制備和生產工藝
1．一般要求
（1）制備和生產條件及環境說明。強調基因治療制品的制備和生產須按GMP要求進行，特別是對exvivo方式的細胞制品和重組病毒制品。臨床前研究和臨床研究用的重組病毒制品應該在經驗證的（validatable）生產工藝途徑下制備。
（2）詳細的制備和生產工藝方法、材料和技術路線。
（3）制備和生產過程控制。在生產過程中，一些步驟必須進行監測，并要求有監測記錄。
（4）一批制品生產的原始制造及檢定記錄。
（5）中國藥品生物制品檢定所或由國家藥品監督管理局指定的單位對一批制品的檢定報告。

2．以重組病毒作為基因治療制品者，要求必須建立種子病毒庫和工作病毒庫。工作病毒庫直接從種子病毒庫病毒接種細胞傳代制備。需詳細描述病毒庫的來源、建立、克隆性，傳代和保存條件和方法。其質量控制方法和標準見本指導原則有關部分。須從工作細胞庫細胞復蘇，傳代成生產細胞開始工藝過程，不得用非細胞庫來源的細胞直接進行生產。做重組病毒制品時，須使用工作病毒庫的病毒去感染生產細胞，不得用非病毒庫來源的病毒直接進行生產。可以使用貼壁細胞或懸浮細胞大規模培養技術。病毒庫可以不經過純化而直接從細胞裂解液來制備。制劑配方也十分重要，不合適的制劑配方會影響制品活性和保存期限。

3．非病毒型重組質粒DNA復（混）合物作為最終制品者，要求需詳述。
（1）重組質粒DNA的生產制備和質控
（2）脂質體的來源和性質，或者制備方法
（3）多肽的來源和性質，或者合成方法
（4）其它成分的來源和性質，或者制備方法
（5）重組質粒DNA復（混）合物終制品的生產制備和質控
通過基因槍等物理和化學方法將基因導入人體者，需說明目的基因的制備、表達、裸DNA大量擴增、分離、純化，儀器設備的性能和詳細的導入方法。

4．以基因工程化的細胞為最終制品者，包括exvivo及其它形式的基因治療。該類制品應參照《人體細胞治療研究和制劑質量控制技術指導原則》進行。詳細說明細胞擴增的全部制備工藝，包括生產流程、所用培養液及其配制方法、細胞收集、細胞的exvivo轉染方法及篩選。洗滌最終制品中所用的保存液配方。

（四）制品的質量控制
根據基因治療類制品的生產工藝特點，其質量控制的原則主要是：檢定項目盡可能在成品中進行；如成品中的添加成份影響檢定結果，則需在原液中進行。
1．重組病毒作為基因治療制品的質量控制
根據目前國內外的進展和完善程度，這里以重組腺病毒（rAd）制品制品來描述重組病毒基因治療制品的質量控制，其它的重組病毒制品可參考這些質控要點。
（1）重組腺病毒（rAd）作為基因治療制品的質量控制
①原液檢定：
a．無菌試驗
按2000年版《中國生物制品規程》附錄《生物制品無菌試驗規程》進行。
b．病毒顆粒數測定
c．具有感染能力病毒顆粒的測定（病毒活性）

②半成品檢定
a．無菌試驗
b．病毒顆粒數測定
c．內毒素測定

③成品檢定
a．物理檢查
b．外觀
c．裝量
d．化學檢定：pH值
e．鑒別試驗
限制性酶切圖譜鑒別
插入基因檢測
f．純度：可采用A260nm/A280nm值法或HPLC法
g．病毒滴度測定
病毒顆粒數測定,采用A260紫外吸收法測定。?
具有感染能力病毒顆粒的測定,采用TCID50法。〖ZK）〗
病毒比滴度（比活性IU）,病毒感染滴度/病毒顆粒數（IU／VP）應高于3．3％。
h．效力試驗
插入基因表達活性測定
插入基因的生物學活性測定
i．復制型病毒（RCA）檢測
A549細胞檢測法，每3．0×1010VP中應不高于1RCA（即≤1RCA/3．0×1010VP）
j．腺相關病毒的檢測
采用PCR法，應無腺相關病毒（AAV）的污染。
k．殘留量測定
應根據生產工藝及成品的添加成份，對有潛在危險性的成份進行殘留量檢測。
l．無菌試驗
m．異常毒性試驗
n．內毒素檢測
重組病毒制品的穩定性試驗：需對保存條件、保存液配方及至少對三批樣品進行穩定性考察。應進行不同溫度及反復凍融對活性影響的研究。

（2）以exvivo形式用逆轉錄病毒轉化的細胞（同體或異體）制品的質量控制
該類制品應參照《人體細胞治療研究和制劑質量控制技術指導原則》進行。應特別注意復制型病毒的檢測。檢測的范圍，包括前述種子細胞庫、工作細胞庫，生產后細胞及最后病毒制品。細胞上清液的取樣應相當于培養上清液的5％。生產病毒后細胞取樣量須達每批中1％或108細胞（取少的）。檢測方法應包括至少5代的細胞共培養擴增（如用Musdunni細胞），隨后須用PG4S /L-法、標記挽救法或RT／PCR中的兩種方法來檢測。必須用陽性對照（COS4070A上清液）及陰性對照作嚴格定量標化，證明其敏感性及可靠性。PCR應利用放射性同位素雜交或同樣敏感的系統。

若為釋放病毒的細胞，須測定：
①細胞形態、表面標志、染色體組型及其同一性。
②活細胞比例和細胞濃度。
③目的基因存在狀態、表達及其穩定性。尤其要說明對基因及其載體導入后是否出現基因"插入性突變"及其觀察方法及結果。
④細胞凍融后的質控
凍融后細胞存活數、基因表達或轉導基因的活性。
凍融后細胞上清液中的下列檢測結果：
a．無菌試驗
b．熱原質實驗
c．凍融后細胞的異常毒性試驗。
d．病毒轉導基因活性。
e．支原體檢查。

若為逆轉錄病毒上清液，須測定：
①病毒滴度
②病毒結構檢定
③病毒轉導基因的活性
④復制型病毒（RCR）的檢測。由于逆轉錄病毒或RCR具有
整合入人細胞染色體的特性，有遺傳性毒性，因此對制品中RCR的檢測要嚴格進行和嚴格要求。
⑤上清液中的細菌、熱原質及其它外源因子等。
⑥上清液中牛血清蛋白殘留量。

鑒于某些細胞產品，有效期較短，而有些項目的檢查須較長的時間（如支原體），這些試驗項目可對每批最終產品作留樣檢查，而該檢測結果將為產品的質控提供完整的資料。若留樣檢查發現陽性結果，應及時對生產過程作檢查，對已發放的產品立即采取措施停止使用。

2．非病毒型重組DNA基因治療制品
（1）純度：超螺旋型的含量，細菌基因組DNA、RNA和蛋白殘留量。
（2）DNA結構檢測
（3）脂質體、多肽或金屬粒子等的來源和性質。由于脂質體的形成及多肽類合成過程的隨機性，不可能達到一般化學合成物的均一性及純度，為此應提供不同批號間保證安全有效的可以達到的最大均一性的程度。
（4）無菌試驗
（5）熱原質試驗
（6）過敏試驗
（7）異常毒性試驗
（8）介導目的基因的活性檢測
（9）有害物質殘余量的測定

（五）基因治療的有效性試驗
有效性試驗包括：
1．體外試驗
須證明該外源基因導入細胞后，能表達并能達到治療效果的依據。若屬exvivo，須提供該細胞中目的基因的表達量及細胞導人體內后預期的效果。

2．體內試驗
提供動物實驗結果證明在體內靶組織中基因導入的效率、表達狀態及可達到治療的目的。證明在非靶組織器官中基因表達的分布。動物種類根據實驗模型的需要而定。導入的途徑應盡可能接近于臨床試驗的途徑或條件。由于小動物對某些途徑（如動脈插管）有一定困難，若改變導入途徑須說明原因及依據。
若有些方案在動物中難以觀察其療效（如種族差異），應充分提供有效性的間接或旁證資料或依據。

（六）基因治療的安全試驗
對質控合格的基因治療制劑，須提供以下安全性試驗的資料：
1．總體安全性評估
除了在質控中已規定的各項要求外，對于exvivo用基因工程化的自體或異體細胞導人體，應提供以下資料：
（1）生長因子的依賴性細胞，對其生長行為必須予以監檢。若某細胞株在傳代過程中失去對該生長因子的依賴性，不能再予以使用。
（2）對同種異體細胞的移植，必須從免疫學方面提供其安全性依據。
（3）對異種細胞，必須提供該異種細胞在體內存活的時間及其安全性的依據。
（4）致癌試驗。無論是自體或異體細胞，經基因操作后，均須作致瘤試驗。對于瘤苗類制品，必須提供該瘤細胞經過何種處理能有效地阻止繼續增殖的證據。致癌試驗包括軟瓊脂細胞生長及裸鼠內致癌試驗。
（5）細胞種類均一性的監控。對瘤苗類制品，應提供如何去除非腫瘤細胞的方法、步驟及其可靠性的依據。若從腫瘤組織中分離非腫瘤細胞（如淋巴細胞），則必須提供消除腫瘤細胞的方法、步驟及其可靠性（包括致癌試驗在內）的依據。
（6）復制型病毒的檢測，若應用病毒型導入系統必須嚴格檢查復制型病毒。
（7）添加物：除細胞培養及保存所用的試劑外，某些exvivo或invivo導入基因或細胞時，需要加用其它添加物，對此類物質必須有動物實驗證明其安全性。

2．分子遺傳學的評估
對invivo的治療方案，必須提供動物體內重組病毒或重組DNA制品導入靶組織與非靶組織的分布情況、基因的表達情況。對于exvivo的方案。須提供導入基因的細胞進入體內后的活性和目的基因的表達情況和分布。

3．毒性反應的評估
這是安全性試驗的重要組成部分。invivo的方案必須提供毒性反應的詳細資料。除目的基因可能導致的毒性外，導入系統的安全性評價至為重要，其安全性評估應包括急性毒性（最大耐受量）及長期毒性試驗。毒性試驗所用的劑量，除包括相當于臨床使用劑量（按體重或表面積計算）外，尚需有一個較大的劑量范圍。劑量范圍應包括大于臨床使用劑量以確定最大耐受量。給藥途徑應盡可能模擬臨床給藥或導入的形式。若改變途徑須說明其原因及依據。毒性反應的觀察，除常規檢測項目外。應包括與基因治療相關的檢測指標。
對于exvivo方案，對瘤苗類或淋巴細胞、巨噬細胞類等自體細胞的導入，一般可免做動物急性和長期毒性試驗。但若加入特殊的添加物（如明膠、縫線、特殊的導管等），以及對于某些重要人體臟器內導入（如心、腦、肝等），必須作動物體內毒性作用的試驗，并提供詳細資料。若exvivo方案添加細胞因子，亦必須提供其安全性的資料。對采用皮膚、皮下、肌肉給藥途徑的方案，無論是exvivo或invivo均需提供局部刺激性的資料。

4．免疫學的評估
無論病毒型與非病毒型載體系統，均需注意進入體內后的免疫反應有關的問題，包括過敏反應、排斥反應以及機體的自身免疫反應（如對裸DNA）等，并對可能發生的免疫反應提出相應的監控及處理措施。
對用于改變機體免疫狀態的目的基因及其導入系統（如瘤苗、導入細胞因子基因或輸入基因工程化的免疫細胞），更需提供它所引起的機體免疫改變以及可能的副作用的資料（參照《人體細胞治療研究和制劑質量控制技術指導原則》）。

5．致癌試驗：見本指導原則相關部分。

（七）基因治療臨床試驗方案
基因治療不同于一般生物技術制品的臨床應用，首先是它的復雜性，例如對于exvivo方式，需有經驗的臨床單位和專家將制品輸入或埋入人體的特定組織，甚至通過手術進行操作；二是它的風險性，尚存在許多未知的因素，須對臨床研究的全過程進行嚴密監控，并在申請臨床研究時須提供下列資料：
1．提供申報單位符合GMP生產條件的證明。
2．提供臨床研究單位和直接參與研究人員的名單和簡歷。
3．明確給藥的方式、劑量、時間及療程。如需通過特殊的手術導入治療制劑，須提供詳細的操作過程。
4．一般臨床指標和實驗室檢測。
5．病人及家屬的同意書
6．靶組織和非靶組織的分子生物學檢測。
靶組織和非靶組織的分子免疫學檢測。若導入重組病毒或可能改變機體免疫狀態的制劑，須針對性地提供觀察人體免疫學方面的相關檢測指標及對可能發生的免疫學反應的必要處理措施。
7．可能產生的副作用或不良反應的記錄，建立實施治療方案中的事故報告制度。
8．隨訪的計劃及實施辦法。

（八）倫理學考慮
必須充分重視倫理學的原則，并具體按國家藥品監督管理局GCP規定的要求嚴格實施。包括在實施本方案前，須向病人說明該治療方案屬試驗階段，它可能的有效性及可能發生的風險，同時保證病人有權選擇該方案治療或中止該方案治療，以及保證一旦中止治療能得到其它治療的權利。嚴格保護病人的隱私。在病人及家屬充分理解并簽字后才能開始治療。