（一）、儀器設(shè)備
醫(yī)用微波爐； 水浴鍋。
（二）、試劑
0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容0.5L。0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml，H20 定容0.4L。.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，濃HCl 4ml，H20 定容0.98L，醋酸酐 （用前加）2.5ml。20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸櫞酸鈉 88.2g，H20 定容1L。100×Denhardt's：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容50ml。雜交液：Formamide 5ml，20×SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100×Denhardt's 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。BufferⅠ（pH7.5）：0.1mol/L ris·Cl，0.15mol/L NaCl。BufferⅢ（pH9.5）：0.1mol/L Tris·Cl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2。BufferⅣ（pH8.0）：10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA。
（三）、操作流程
1、使用地高辛標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行石蠟切片的RNA原位雜交第一天
1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；
2） 無(wú)水乙醇浸泡2次，每次3分鐘；
3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分鐘；
4） PBS清洗3分鐘；
5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；
6） PBS清洗10分鐘；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分鐘；
8） PBS清洗2次，每次3分鐘；
9） 0.2N的HCl孵育30分鐘；
10）PBS清洗2次，每次3分鐘；
11）0.25%無(wú)水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；
12）PBS清洗2次，每次5分鐘；
13）預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘；
14）準(zhǔn)備核酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針，85℃加熱5分鐘，置于冰塊中10分鐘；
15）雜交；第二天
16）將玻片置于SSC中2次，每次5分鐘以去除封片；
17）PBS清洗3分鐘；
18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分鐘；
19）PBS清洗5分鐘；
20）室溫，2×SSC清洗10分鐘；
21）37℃，1×SSC清洗10分鐘；
22）37℃，0.5×SSC清洗10分鐘；
23）緩沖液A孵育10分鐘；
24）緩沖液A（1%正常綿羊血清和0.03%三重氫核X-100）孵育30分鐘；
25）加入抗地高辛抗體（1/200的上述緩沖液，來(lái)自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小時(shí)；
26）緩沖液A清洗2次，每次10分鐘；
27）緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；
28）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可延長(zhǎng)到16小時(shí)；
29）停止緩沖液B的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗；
30）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。
2、使用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行石蠟切片的原位DNA雜交第一天
1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；
2） 無(wú)水乙醇浸泡2次，每次5分鐘；
3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分鐘；
4） PBS清洗5分鐘；
5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；
6） PBS清洗5分鐘；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分鐘；
8） PBS清洗2次，每次5分鐘；
9） 0.2N的HCl孵育30分鐘；
10）PBS清洗2次，每次5分鐘；
11）0.25%無(wú)水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；
12）PBS清洗5分鐘；
13）預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘；
14）準(zhǔn)備寡核苷酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針；
15）雜交；第二天
16）將玻片置于SSC中以去除封片；
17）室溫，2×SSC清洗10分鐘；
18）37℃，1×SSC清洗10分鐘；
19）37℃，0.5×SSC清洗10分鐘；
20）緩沖液A孵育10分鐘；
21）緩沖液A孵育30分鐘；
22）加入抗地高辛抗體37℃孵育3小時(shí)；
23）緩沖液A清洗2次，每次5分鐘；
24）緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；
25）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可長(zhǎng)到16小時(shí)；
26）停止緩沖液B的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗；
27）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。
