氣相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結(jié)果，而必須由已知標(biāo)準(zhǔn)作對(duì)照定性。當(dāng)無(wú)純物質(zhì)對(duì)照時(shí)，定性鑒定就很困難，這時(shí)需借助質(zhì)譜、紅外和化學(xué)法等配合。另外大多數(shù)金屬鹽類(lèi)和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)還不能分析。此缺點(diǎn)可高效液相色譜法來(lái)克服。在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論與技術(shù)，在70年代初建立了高效液相色譜分析法（以HPLC表示）。在常壓下操作的液相色譜，分離一個(gè)樣品往往長(zhǎng)達(dá)幾小時(shí)至幾十小時(shí)，因此工作效率很低。人們?cè)鴮?duì)這種經(jīng)典液相色譜法試用了柱前加壓或柱后減壓的辦法來(lái)提高流速，以縮短分離時(shí)間，但是結(jié)果失敗了。根據(jù)液相色譜理論，因?yàn)殡S著載液（流動(dòng)相）流速的提高，板高則增大，所以柱效會(huì)顯著降低。隨著生產(chǎn)技術(shù)的提高，人們制成了細(xì)小（<10μm）而高效的填充物，從而使柱效大大提高。但是隨著填充物粒度的減小，柱壓降顯著增大，為了得到合理的載液流速，使用了高壓；輸液泵，使流速達(dá)到1～10mL/min。從而使分析一個(gè)多組分樣品只需幾分鐘到幾十分鐘時(shí)間。隨著高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測(cè)器以及電子技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的應(yīng)用，70年代以業(yè)逐步實(shí)現(xiàn)了液相色譜分析的高效、高速、高靈敏和自動(dòng)化操作。因此人們常稱(chēng)它為高效液相色譜或現(xiàn)代液相色譜，以區(qū)別于經(jīng)典液相色譜。高效液相色譜法的分類(lèi)與經(jīng)典液相色譜法一致。按固定相的聚集狀態(tài)不同分為液固色譜法和液液色譜法。按分離原理不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜法四類(lèi)。

高效液相色譜所用基本概念：

保留值等色譜分析有關(guān)術(shù)語(yǔ)，以及分配系數(shù)、分配比、塔板高度、分離度、選擇性等方面均與氣相色譜相一致；高效液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率理論也與氣相色譜一致。因液相色譜以液體代替氣相色譜中的氣體作流動(dòng)相，則速率議程H=A B/? C?。式中：縱向擴(kuò)散項(xiàng)（分子擴(kuò)散項(xiàng)）B/?對(duì)板高的影響與氣相色譜不同，由于液相色譜中組分分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)Dm僅為氣相色譜中的萬(wàn)分之一，因此縱向擴(kuò)散項(xiàng)對(duì)板高的影響可以忽略不計(jì)。于是影響液相色譜的主要因素是傳質(zhì)項(xiàng)Cu。由圖14—可知，氣相色譜（GC）的流動(dòng)相流速u(mài)增大時(shí)，板高H顯著增大（即柱效顯著降低），而液相色譜（LC）的流速增大時(shí)，板高增大不顯著（即柱效降低不顯著）。這說(shuō)明高效液相色譜也有很高的分離效能，此外，氣相色譜的載氣權(quán)數(shù)種，其性質(zhì)差別也不大，對(duì)分離效果影響也不大。而液相色譜的載液種類(lèi)多，性質(zhì)差別也大，對(duì)分離效果影響顯著。因此流動(dòng)相的選擇很重要，并且在選擇流動(dòng)相對(duì)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：流動(dòng)相對(duì)樣品有適當(dāng)?shù)娜芙舛龋�但不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，也不與固定液互溶；流動(dòng)相的純度要高（至少分析純）、粘度要小，以免帶進(jìn)雜質(zhì)和組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)下降；流動(dòng)相應(yīng)與所用檢測(cè)器相匹配，不應(yīng)對(duì)組分檢測(cè)產(chǎn)生干擾作用。高效液相色譜不但具有高效、高速、高靈敏度的特點(diǎn)，還由于它的流動(dòng)相（載液）種類(lèi)比氣相色譜的流動(dòng)相（載氣）多，因此可選用兩種或多種不同比例的液體作流動(dòng)相，從機(jī)時(shí)可提高選擇性。此外，液相色譜的餾分比氣相色譜易于收集。便于為紅外、核磁等方法確定化合物結(jié)構(gòu)提供純樣品。由于高效液相色譜法具有以上特點(diǎn)，它適于分離、分析沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性差、分子量大（大于400）的氣相色譜法不能或不易分析的許多有機(jī)物和一些無(wú)機(jī)物，而這些物質(zhì)占化合物總數(shù)的75～80%。因此它已廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、糖類(lèi)、脂類(lèi)、甾類(lèi)化合物、激素、生物堿、稠環(huán)芳烴、高聚物、金屬螯合物、金屬有機(jī)化合物以及多種無(wú)機(jī)鹽類(lèi)的分離和分析。但是，高效液相色譜的固定相的分離效率、檢測(cè)器的檢測(cè)范圍以及靈敏度等方面，目前還不如氣相色譜法。此外對(duì)于氣體和易揮發(fā)物質(zhì)的分析方面也遠(yuǎn)不如氣相色譜法，因此高效液相色譜法和氣相色譜法配合使用可互相取長(zhǎng)補(bǔ)短，相輔相成。

1.分離原理
凝膠色譜，又稱(chēng)空間排阻色譜。它是利用某些凝膠對(duì)混合物各組分因分子量不同，其阻滯作用也不同而進(jìn)行分離、分析的方法。凝膠色譜的分離要理和其它色譜法不同，它類(lèi)似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。色譜柱內(nèi)填充具有一定大小孔穴的凝膠。當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，不同大小的樣品分子（圖14—2中以黑點(diǎn)表示）隨流動(dòng)相沿凝膠顆粒（圖14—2中以空心圈表示）外部間隙和凝膠孔穴旁流過(guò)，體積在的分子因不能滲透到凝膠孔穴里而得到排阻，因此較為順利地通過(guò)凝膠柱而較早地被流動(dòng)相沖洗出來(lái)。中等體積的分子產(chǎn)生部分滲透作用，小分子可滲透到凝膠孔穴里去而受阻滯，因有一個(gè)平衡過(guò)程而較晚地被流動(dòng)相沖洗出來(lái)。這樣，試樣組分基本上按分子大小受到不同阻滯而先后流出色譜柱，從而實(shí)現(xiàn)分離目的。光凝膠色譜采用水溶液作流動(dòng)相進(jìn)，稱(chēng)為過(guò)濾凝膠色譜（HFC），而用有機(jī)溶劑為流動(dòng)相時(shí)，稱(chēng)為凝膠滲透色譜（GPC）。

2．固定相
凝膠色譜的固定相凝膠，是含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立柱網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。根據(jù)凝膠的交聯(lián)程度和含水量的不同，分了軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)三種。軟質(zhì)凝膠（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等）交聯(lián)度低，膨脹度大，容量大，可壓宿，不能用于高壓（使用壓力低于3.5kg/㎝2或更低），主要用于含水體系的常壓凝膠色譜，半硬質(zhì)凝膠（如苯乙烯一二乙烯基苯交聯(lián)共聚凝膠），容量中等，滲透性較高，壓力可用到70kg/㎝2。適用于非水溶劑流動(dòng)相；硬質(zhì)凝膠（如多孔硅膠、多也玻球等），膨脹度小，不可壓縮，滲透性好，可耐高壓，適于高流速下操作。

3．流動(dòng)相
在凝膠色譜中，為提高分率效率，多采用低粘度、與樣品折光指數(shù)相差大的流動(dòng)相。常用的流動(dòng)相有苯、甲苯、鄰二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。