甲醇酵母基因表達(dá)系統(tǒng)是一種最近發(fā)展迅速的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)。甲醇酵母是可利用甲醇作為唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三種，其中Pichia Pastoris作為基因表達(dá)系統(tǒng)使用得最多、最廣泛［1］。與以往的基因表達(dá)系統(tǒng)相比，它具有無(wú)可匹敵的高表達(dá)特性，已被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的工具之一。
1. 外源蛋白質(zhì)的基因在甲醇酵母中的高效表達(dá)
目前已有多種蛋白質(zhì)的基因在該表達(dá)系統(tǒng)中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制劑、受體、單鏈抗體等(表1)。盡管各種外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水平不一，但各種蛋白質(zhì)在甲醇酵母中的產(chǎn)生水平均為在細(xì)菌、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物等表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)量的10～100倍［2］。如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)在釀酒酵母中的產(chǎn)量為7.4mg/L，而在甲醇酵母中為450mg/L，提高了60倍［3］。椐報(bào)道，外源蛋白質(zhì)在甲醇酵母中的產(chǎn)量最高可達(dá)12g/L［9］。
表1 外源蛋白質(zhì)在甲醇酵母中的高效產(chǎn)生
| 外源蛋白質(zhì) | 產(chǎn)生量(g/L) | 文獻(xiàn) |
| 轉(zhuǎn)化酶 | 2.3 | ［4］ |
| D-丙氨酸羧肽酶 | 0.8 | ［5］ |
| α-淀粉酶 | 2.5 | ［6］ |
| Kunitz蛋白酶抑制劑(AbPP) | 1.0 | ［7］ |
| 瞬時(shí)抗凝蛋白(TAP) | 1.7 | ［8］ |
| 破傷風(fēng)毒素片段C | 12.0 | ［9］ |
| 百日咳抗原P69 | 3.0 | ［10］ |
| 人免疫缺陷病毒1膜外糖蛋白gp120 | 1.3 | ［11］ |
| 腫瘤壞死因子(TNF) | 10.0 | ［12］ |
| 人轉(zhuǎn)鐵蛋白N端 | 4.0 | ［13］ |
2. 實(shí)現(xiàn)外源蛋白質(zhì)高效產(chǎn)生的關(guān)鍵因素
2.1 表達(dá)載體 首先，甲醇酵母中沒(méi)有穩(wěn)定的質(zhì)粒，所以其表達(dá)載體采用整合型質(zhì)粒。利用醇氧化酶(甲醇代謝的關(guān)鍵酶)基因-1(AOX1)的啟動(dòng)子(PAOX1)和轉(zhuǎn)錄終止子(3′AOX1)構(gòu)建成整合型表達(dá)載體。PAOX1是一個(gè)極強(qiáng)的啟動(dòng)子，醇氧化酶的產(chǎn)量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白質(zhì)的30%［2］，所以能使外源蛋白質(zhì)在它的控制下高效產(chǎn)生。其次，在載體中加入釀酒酵母的分泌信號(hào)和前導(dǎo)肽序列(α因子)構(gòu)建分泌型載體，一方面可以減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷，另一方面可以減少宿主細(xì)胞蛋白水解酶對(duì)外源蛋白質(zhì)的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均為此類載體。此外，使多拷貝目的基因整合入甲醇酵母染色體，形成多個(gè)表達(dá)單元，產(chǎn)生高產(chǎn)的菌株，此類載體有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。
2.2 受體菌 在以葡萄糖或甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，甲醇酵母中AOX1基因的表達(dá)受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時(shí)，誘導(dǎo)基因表達(dá)，使外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量更高。甲醇酵母適合高密度連續(xù)培養(yǎng)的條件，細(xì)胞干重達(dá)100g/L以上，蛋白質(zhì)產(chǎn)量極高［14］。受體菌采用蛋白水解酶缺陷型，從而大大降低產(chǎn)物的降解。常用的甲醇酵母受體菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。?
3. 應(yīng)用前景
經(jīng)過(guò)近幾年的發(fā)展完善，甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)已日趨成熟，應(yīng)用也日趨廣泛。國(guó)內(nèi)已有多篇在甲醇酵母中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)成功的報(bào)道(表2)。美國(guó)Invitrogen公司也已開(kāi)發(fā)出多種新型的甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)試劑盒，如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等，利用甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)克隆一個(gè)外源基因已十分方便。相信隨著對(duì)甲醇酵母研究的進(jìn)一步深入，它在生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)方面將日益展示出誘人的前景。
表2 國(guó)內(nèi)利用甲醇酵母產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)
| 外源蛋白質(zhì) | 產(chǎn)生量(g/L) | 文獻(xiàn) |
| 人胰島素 | 0.25 | ［15］ |
| 人胰島素原 | 0.3 | ［16］ |
| 人p53蛋白 | 0.2 | ［17］ |
| 辣根過(guò)氧化物酶 | 4～6 | ［18］ |
| 人基質(zhì)金屬蛋白酶-9 | 0.01 | ［19］ |
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