凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等。它的突出優點是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，并且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。對于高分子物質有很好的分離效果。
⒈凝膠的選擇根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開，由于它們在分配系數上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用Sephadex G-25和G-50，對于小肽和低分子量的物質（1000-5000）的脫鹽可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質的凝膠，層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部，由于Kd不同，最后得到分離。
⒉柱的直徑與長度根據經驗，組別分離時，大多采用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內，小于1cm產生管壁效應，大于5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質宜在30-40之間。
⒊凝膠柱的制備凝膠型號選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內充滿洗脫液，將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛于柱頂的容器中，然后在微微地攪拌下使凝膠下沉于柱內，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應低于層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無“紋路”或氣泡，或加一些有色物質來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。
⒋加樣和洗脫凝膠床經過平衡后，在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5％-10％。樣品濃度與分配系數無關，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2。樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預先設計好流速，然后分部收集洗脫液，并對每一餾份做定性、定量測定。
⒌凝膠柱的重復使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02％的疊氮鈉，在下次層析前應將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。
如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70％、90％、95％乙醇脫水平衡至乙醇濃度達90％以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。
⒍凝膠層析的應用
⑴脫鹽：高分子（如蛋白質、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱長與直徑之比為5-15，樣品體積可達柱床體積的25％-30％，為了防止蛋白質脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發性鹽類。
⑵用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質的分離提純。凝膠對熱原有較強的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。
⑶測定高分子物質的分子量：用一系列已知分子量的標準品放入同一凝膠柱內，在同一條件下層析，記錄每一分鐘成分的洗脫體積，并以洗脫體積對分子量的對數作圖，在一定分子量范圍內可得一直線，即分子量的標準曲線。測定未知物質的分子量時，可將此樣品加在測定了標準曲線的凝膠柱內洗腫后，根據物質的洗脫體積，在標準曲線上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時水分和低分子量的物質就會進入凝膠粒子內部的孔隙中，而高分子物質則排阻在凝膠顆粒之外，再經離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。
