DNA經過限制性內切酶消化和凝膠電泳后，放入堿性溶液中使其變性，將變性后的單鏈DNA從凝膠中按原來位置和順序用濾紙吸印轉移到硝酸纖維膜上，然后再與標記探針雜交。此方法比較準確地保持了特異DNA序列在電泳圖譜中的位置，而且能測定分子量。
試劑：變性液：0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl
中和液：1mol/L Tris-HCl, 1.5mol/L NaCl pH8.0
20×SSC:0.3mol/L檸檬酸鈉，3mol/L NaCl
1．電泳
取DNA約5μg加限制性內切酶進行酶切，電泳鑒定酶切完全后， 取酶消化后的DNA點樣于0.8%～1.2%的凝膠上，以0.8～1V/cm電壓電泳過夜，在溴酚藍離凝膠前緣0.5cm處停止電泳。將電泳后的凝膠翻轉，紫外燈照射10～20min后拍照。
2．變性與中和
將電泳后的凝膠放入變性液中25℃振蕩60min。
蒸餾水洗膠1min，將凝膠放入中和液中25℃振蕩60min。
3．轉移
取托盤一只，放入10×SSC溶液約500～1000ml，托盤上搭一塊比凝膠稍寬的長方形玻璃，取一長方形濾紙搭在橋上，兩邊浸入10×SSC溶液中，仔細去掉玻璃與濾紙之間的氣泡（用玻棒在濾紙上滾動）。將凝膠放在濾紙上，去掉凝膠與濾紙之間的氣泡。將硝酸纖維膜放入2×SSC溶液中浸濕后放在凝膠上（如NC膜浸濕不均勻，則考慮更換NC膜，操作時手切勿觸及NC膜），去掉凝膠與NC膜之間的氣泡。將一張濾紙（長和寬均比NC膜小1mm）放在NC膜上，仔細去掉氣泡。將吸水紙切成與濾紙大小，重疊放在濾紙上，再壓一重物約500～1000g。轉膜24h，中間更換吸水紙。
4．固定
用2×SSC溶液洗膜5min去掉殘余凝膠，讓膜自然晾干。將凝膠放入EB液中30min，取出在UV燈下觀察是否有DNA殘余。80℃烤膜2h，然后將膜封入塑料袋進行雜交。
