1 DNA純度
在DNA樣品中若含有蛋白質，或沒有去除干凈制備過程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高濃度金屬離子，均會降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。
2 核酸內切限制酶的緩沖液
核酸內切限制酶的標準緩沖液包括氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、Tris-HCL、巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。
使用所有限制酶均可發揮活性的一種緩沖液。
不同限制性內切酶對NaCl濃度的要求不同，這是不同限制酶緩沖液組成上的一個主要的不同。據此可分為高鹽、中鹽和低鹽緩沖液，在進行雙酶解或多酶解時，若這些酶切割可在同種緩沖液中作用良好，則幾種酶可同時酶切；若這些酶所要求的緩沖液有所不同，可采用以下三種方法進行消化反應：先用要求低鹽緩沖液的限制性內切酶消化DNA，然后補足適量的NaCl，再用要求高鹽緩沖液的限制酶消化；
先用一種酶進行酶解，然后用乙醇沉淀酶解產物，再重懸于另一緩沖液中進行第二次酶解。
3 酶切消化反應的溫度
DNA消化反應的溫度，是影響限制內切酶活性的一個重要因素。不同的核酸內切限制酶，具有各自的最適反應溫度。多數限制內切酶的最適反應溫度是37℃，少數限制性內切酶的最適反應溫度高于或低于37℃。
4 DNA的分子結構
DNA分子構型對核酸內切限制酶的活性有很大影響，如消化超螺旋的DNA比消化線性DNA用酶量要高出許多倍。
有些限制酶在消化它們自己的處于不同部位的限制位點，其效率也有明顯差異。
限制性內切酶反應的終止 通常是采用65℃條件下溫浴5min；
加終止反應液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的終濃度達到10 mol/L）螯合Mg2 ，以終止反應。
