蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系，可以進行蛋白質含量的測定。
紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH4）2SO4等和大多數緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測，因為此時只需測定蛋白質濃度的變化，而不需知道其絕對值。
此法的特點是測定蛋白質含量的準確度較差，干擾物質多，在用標準曲線法測定蛋白質含量時，對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當的校正。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經過校正，測定的結果還是存在一定的誤差。
此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的pH要與測定標準曲線的pH相一致。
1. 280nm的光吸收法
因蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
測定時，將待測蛋白質溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取280nm的吸光度值A280。蛋白質濃度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標準石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質溶液時，A280約為1.0左右。由此可立即計算出蛋白質的大致濃度。
許多蛋白質在一定濃度和一定波長下的光吸收值（A1％1cm）有文獻數據可查，根據此光吸收值可以較準確地計算蛋白質濃度。下式列出了蛋白質濃度與（A1％1cm）值（即蛋白質溶液濃度為1%，光徑為1cm時的光吸收值）的關系。文獻值A1％1cm,λ稱為百分吸收系數或比吸收系數。
蛋白質濃度 = (A280´10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)
(Q 1%濃度»10mg/ml)
2. 280nm和260nm的吸收差法
核酸對紫外光有很強的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質強10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數是280nm處的2倍，而蛋白質則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：
純蛋白質的光吸收比值：A280/A260 » 1.8
純核酸的光吸收比值： A280/A260 » 0.5
含有核酸的蛋白質溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經驗公式，即可算出蛋白質的濃度。 蛋白質濃度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)
此經驗公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數據來建立的。
3. 215nm與225nm的吸收差法
蛋白質的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標準曲線法來測定蛋白質稀溶液的濃度。
用已知濃度的標準蛋白質，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度值，并計算出吸收差： 吸收差D= A215 －A225
以吸收差D為縱座標，蛋白質濃度為橫座標，繪出標準曲線。再測出未知樣品的吸收差，即可由標準曲線上查出未知樣品的蛋白質濃度。
本方法在蛋白質濃度20~100mg/ml范圍內，蛋白質濃度與吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等緩沖液，都無顯著干擾作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、巴比妥等緩沖液的215nm光吸收值較大，必須將其濃度降到0.005M以下才無顯著影響。
4. 肽鍵測定法
蛋白質溶液在238nm處的光吸收的強弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標準蛋白質溶液配制一系列50~500mg/ml已知濃度的5.0ml蛋白質溶液，測定238nm的光吸收值A238，以A238為縱座標, 蛋白質含量為橫座標，繪制出標準曲線。未知樣品的濃度即可由標準曲線求得。
進行蛋白質溶液的柱層析分離時，洗脫液也可以用238nm檢測蛋白質的峰位。
本方法比280nm吸收法靈敏。但多種有機物，如醇、酮、醛、醚、有機酸、酰胺類和過氧化物等都有干擾作用。所以最好用無機鹽，無機堿和水溶液進行測定。若含有有機溶劑，可先將樣品蒸干，或用其他方法除去干擾物質，然后用水、稀酸和稀堿溶解后再作測定。
